克罗恩病衰老相关基因特征：整合批量与单细胞RNA测序分析揭示疾病新机制

《Scientific Reports》：Senescence-related gene signatures in Crohn’s disease: integrating bulk and single-cell RNA sequencing analysis

　　本研究针对克罗恩病(CD)中细胞衰老作用机制不清的问题，通过整合批量RNA-seq和scRNA-seq数据，结合机器学习算法，鉴定出STAT1、S100A11等5个衰老相关关键基因，构建了高精度诊断模型。研究发现衰老细胞通过SASP促进肠道纤维化和免疫失调，单细胞分析揭示成纤维细胞和上皮细胞是主要衰老细胞类型，为CD治疗提供了新的潜在靶点。

　　

在消化系统疾病领域，克罗恩病(Crohn's disease, CD)一直是一个令人困扰的难题。这种慢性复发性炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)可以影响从口腔到肛门的任何胃肠道段，尤其偏好末端回肠和结肠。全球范围内CD的发病率持续上升，虽然生物制剂的应用改善了一些患者的预后，但仍有相当比例患者面临治疗失败或术后复发的困境。

近年来，研究人员注意到一个有趣的现象：CD患者的肠道组织表现出类似早衰的特征。细胞衰老是一种由DNA损伤、端粒缩短或氧化应激等因素诱导的细胞周期停滞状态，通常伴随着衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP)。这种表型通过分泌促炎因子和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)加剧局部炎症和组织损伤。研究表明，慢性炎症会加速细胞衰老，而衰老细胞又通过SASP放大炎症反应，形成自我强化的恶性循环。这种慢性炎症与细胞衰老之间的自我延续相互作用，很可能驱动了CD的疾病进展。

尽管CD主要影响年轻人，而细胞衰老传统上被视为与衰老相关的过程，因此其在CD发病机制中的作用可能长期被低估。虽然已在CD患者肠道中检测到衰老标志物的异常表达，但关于细胞衰老如何影响CD进展的系统研究仍然不足。阐明细胞衰老对CD进展的影响，不仅会加深我们对疾病的理解，还可能为开发新型抗衰老治疗策略提供理论基础。

在这项发表于《Scientific Reports》的研究中，研究人员通过整合RNA-seq和scRNA-seq数据，系统分析了CD患者肠道组织中细胞衰老相关基因的表达模式和异质性分布。他们成功利用机器学习算法构建了基于CD相关衰老基因的诊断预测模型，并在多个独立外部数据集中验证了其预测效能。小鼠模型和临床样本进一步证实了预测模型中关键基因在CD中的差异表达，为细胞衰老参与CD进展提供了直接证据。

研究团队主要采用了以下几种关键技术方法：从GEO数据库获取了包括三个批量RNA-seq数据集和一个单细胞RNA-seq数据集；通过差异表达分析与衰老基因集交叉识别CD相关衰老差异表达基因；运用LASSO回归、随机森林和支持向量机三种机器学习算法进行特征筛选；使用CIBERSORT算法进行免疫细胞浸润分析；利用Seurat包进行单细胞转录组数据分析；通过DSS诱导的小鼠模型和临床样本验证关键基因表达。

Identification of SR-DEGs in CD

研究人员首先对GSE75214数据集进行差异表达分析，共识别出1,237个差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)，其中828个上调，409个下调。通过将这些DEGs与衰老相关基因集交叉，最终确定了20个CD衰老相关差异表达基因(senescence-related differentially expressed genes, SR-DEGs)，包括18个上调基因和2个下调基因。

Functional Characterization of SR-DEGs

对SR-DEGs的功能富集分析显示，这些基因显著富集于上皮细胞增殖/分化调控、细胞因子产生正向调控等生物过程，以及细胞外基质结构成分等分子功能。KEGG通路分析表明，糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路变化最为显著，同时多个免疫炎症通路也明显富集，包括IBD、IL-17信号通路、TGF-β信号通路等。

Identification of hub genes

通过三种机器学习方法(LASSO回归、支持向量机和随机森林)的特征选择，研究团队最终确定了五个核心基因：STAT1、S100A11、FILIP1L、F3和HPS5。这些基因在活动性CD样本中表达一致上调，且相互之间存在正相关关系。ROC曲线分析证实这些核心基因单独或作为组合诊断模型都具有优异的CD诊断潜力。

GSEA of hub genes

通过hub基因与其他基因相关性的GSEA分析，研究人员系统描述了它们的功能特征。结果显示所有hub基因均与氧化磷酸化(oxidative phosphorylation, OXPHOS)通路呈显著负相关，而与病毒蛋白-细胞因子受体相互作用通路呈正相关。大多数hub基因(≥3个)与三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle, TCA循环)和多种营养吸收/代谢通路呈显著负相关，而与造血细胞谱系、破骨细胞分化等呈正相关。

The correlation between hub gene expression and immunological characteristics

免疫浸润分析显示，CD患者与健康对照相比，12种免疫细胞亚型存在显著改变。相关性分析发现，大多数hub基因(≥4个)与活化树突状细胞、M0/M1巨噬细胞、中性粒细胞等的浸润水平呈正相关，而与静止肥大细胞、单核细胞等呈负相关。

Diagnostic model performance validation and disease model construction

在独立数据集GSE102133和GSE36807中，模型均表现出优异的预测性能。DSS诱导的小鼠模型和临床样本验证进一步证实了hub基因在CD中的表达上调。

Identification of 9 cell types in CD patients

单细胞转录组分析共鉴定出9种主要细胞类型：成纤维细胞、树突状细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞、浆细胞和NK细胞。匹配的结肠样本分析显示，受累区域上皮细胞比例比非受累区域减少两倍。

Senescence-Associated Gene Expression Patterns in CD Patients from scRNA-seq Data

衰老相关基因评分显示内皮细胞和成纤维细胞是得分最高的细胞类型，而hub基因评分则发现成纤维细胞和巨噬细胞得分最高。比较分析表明，CD受累区域的衰老相关基因和hub基因评分均显著高于非受累区域。

Analysis of Fibroblast and Epithelial cell subpopulations in CD patients

成纤维细胞亚群分析发现六个不同的亚簇，其中亚簇1和亚簇3在受累和非受累区域间显示显著比例差异。亚簇1中多种胶原相关分子和衰老标志物(CDKN1A、CDKN2A)表达显著升高，而干性相关基因SOX2则显著下调。上皮细胞分析发现四个亚簇，其中代谢重编程的上皮细胞簇0在受累区域比例下调，而高表达CDKN2A的衰老上皮细胞在亚簇3中富集。

Identification of core senescence-associated signaling pathways by GSVA

GSVA分析显示，上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)通路在所有细胞类型中均与衰老评分呈显著正相关。其他包括炎症反应、TNFA信号 via NFKB、凋亡和缺氧等通路也在多种细胞类型中与衰老评分呈强正相关。

研究结论和讨论部分强调，这项研究基于批量和单细胞转录组学，系统描绘了CD中衰老相关基因的表达景观，鉴定了一个由五个衰老相关基因组成的新型CD诊断预测模型，为理解细胞衰老与CD之间的关系提供了新见解，为开发针对细胞衰老的治疗策略奠定了分子基础。

五个已鉴定的CD相关hub基因可能在CD进展中发挥重要作用：STAT1作为干扰素(interferon, IFN)信号通路的核心调节因子，可通过慢性炎症刺激持续激活，从而加速细胞衰老。S100A11可能通过激活NF-κB通路维持慢性炎症。除了其在凝血中的经典作用外，新证据表明F3可以通过PAR2受体信号触发巨噬细胞活化和TNF-α分泌。HPS5编码溶酶体相关细胞器生物发生复合体2(biogenesis of lysosome-related organelles complex 2, BLOC-2)的核心组分。肌动蛋白结合蛋白FILIP1L密切参与细胞骨架动力学、细胞运动和信号转导，并被证明可调节上皮-间质转化。

值得注意的是，本研究发现HPS5和FILIP1L在CD中表现出独特的表达模式：虽然批量RNA测序显示它们在CD组织中整体上调，但单细胞转录组分析显示它们在非病变区域有更高的表达趋势。这些发现表明HPS5和FILIP1L可能参与相对未受累肠段的补偿性保护机制。

在单细胞转录组分析部分，研究人员揭示了CD组织微环境中细胞衰老的异质性景观：成纤维细胞表现出最显著的衰老表型，促纤维化亚群特异性富集于病变区域，而神经元样S100B+亚群主导非病变区域。这种空间分布模式高度对应CD特征性的"跳跃性病变"病理学，表明衰老相关成纤维细胞可能是驱动肠壁纤维化区域异质性的关键效应细胞。在上皮细胞中，研究人员观察到高表达CDKN2A的衰老上皮细胞在病变区域显著富集，为CD进展过程中上皮再生能力逐渐下降提供了直接证据。

本研究也存在一些局限性。模型是使用未经治疗和正常肠黏膜样本构建的，这排除了治疗前后生物疗法引起的局部遗传变异差异，使其更适用于初治CD患者的诊断预测。因此，缺乏对治疗前后或复发与非复发CD组织中衰老相关基因表达谱的系统分析。此外，当前的单细胞RNA测序技术无法区分黏膜层和全层肠壁组织，从而限制了衰老相关基因表达模式的空间分辨率。

总之，这项研究为理解CD的疾病异质性提供了新视角，并为开发针对细胞衰老的治疗策略奠定了分子基础。