新型嗜热菌 Thermus thermophilus 与大肠杆菌（Escherichia coli）之间的穿梭载体的开发

《Applied and Environmental Microbiology》：Development of new Thermus thermophilus—Escherichia coli shuttle vectors

　　基因组分析发现日本仙米温泉分离的Thermus thermophilus菌株携带多个新型质粒，其复制蛋白（REP）与常用pTT8型载体不同，其中两个质粒含下游串联的短开放阅读框（ORFs），形成毒素-抗毒素样模块，显著增强质粒在无抗生素条件下的稳定性（pIOK1和pIOK9）。构建的pIOK系列载体与pTT8型载体兼容，并成功分拆Thermus brockianus的13 kbp木糖代谢通路至两个兼容质粒中，在重组菌株中恢复木糖利用能力。定量PCR显示pIOK载体拷贝数是染色体（polI基因）的1.22-3.29倍。该成果为合成生物学研究提供了稳定的载体系统和高效的多质粒管理工具。

　　### 热泉微生物基因组研究揭示新型质粒系统

在一项关于日本热泉中分离的 *Thermus thermophilus*（嗜热菌）菌株的基因组分析中，科学家们发现了多个质粒的存在。这些质粒与常用的 pTT8 类型质粒不同，其中五种质粒携带了具有潜在复制功能的复制蛋白（REP 蛋白）。值得注意的是，其中两种质粒在 REP 蛋白下游还包含了一组类似毒素-抗毒素的串联开放阅读框（ORFs）。为了进一步探索这些质粒的复制机制和功能，研究人员构建了一系列穿梭载体 pIOK，将这些 REP 蛋白及其相邻区域克隆进 *E. coli* 的 ColE1 类型质粒中，并引入了一种耐热的链霉素抗性基因（*hph5*）。这些穿梭载体在 *T. thermophilus* HB27 中表现出稳定的复制能力，即使在没有链霉素的情况下，其中两种携带毒素-抗毒素模块的质粒也显示出显著的复制稳定性，能够在 168 代的无抗生素培养中保持不丢失。这一发现不仅表明毒素-抗毒素模块对质粒稳定性的增强作用，还展示了其在 *Thermus* 质粒系统中的广泛应用潜力。

### 基因组数据推动合成生物学研究

随着对 *T. thermophilus* 基因组数据的不断积累，科学家们发现了一些具有新型复制起点的质粒。这些质粒与传统的 pTT8 类型质粒相比，显示出不同的序列特征和功能特性。为了满足合成生物学研究的需求，研究人员开发了一种新型的穿梭载体 pIOK，该载体不仅兼容现有的 pTT8 基础穿梭载体，还能够在 *T. thermophilus* 中实现稳定的复制和维持。这一进展为基因工程和功能基因组学研究提供了重要的工具，使得在高温条件下进行复杂的基因操作成为可能。

### 新型穿梭载体的构建与验证

研究人员通过 PCR 技术放大了这些新型质粒中的 REP 蛋白及其相邻区域，并将其克隆进 *E. coli* 的 ColE1 类型质粒 pHSG298Hg 中，以构建 pIOK 系列穿梭载体。这些载体在 *T. thermophilus* HB27 中表现出良好的复制稳定性，即使在没有抗生素的情况下，也能维持较高的拷贝数。此外，pIOK 系列穿梭载体之间以及与 pTT8 类型质粒之间的兼容性得到了验证，表明它们可以在同一细胞内共存而不发生冲突。这种兼容性为构建多基因表达系统提供了便利，使得复杂的基因功能研究得以在单一宿主中进行。

### 毒素-抗毒素模块的功能验证

为了进一步验证毒素-抗毒素模块的功能，研究人员对 pIOK1 和 pIOK9 进行了基因修饰，分别删除了其中一个 ORF。结果显示，删除第一个 ORF 的 pIOK9D1 在 *T. thermophilus* 中仍能稳定维持，而删除第二个 ORF 的 pIOK9D2 则无法维持。这一结果表明，第二个 ORF 可能起到了中和第一个 ORF 毒性的作用，从而增强了质粒的稳定性。通过 AlphaFold 3 预测的三维结构分析，进一步支持了这两个 ORF 形成了一种类似于 II 型毒素-抗毒素系统的可能性。这种模块的发现为提高质粒在高温环境下的稳定性提供了新的思路。

### 质粒拷贝数的定量分析

为了评估这些新构建的穿梭载体在 *T. thermophilus* 中的拷贝数，研究人员采用了定量 PCR（qPCR）技术。通过比较 *hph5* 基因和 *polI* 基因的拷贝数，发现 pIOK 系列质粒的拷贝数是染色体拷贝数的 1.22 到 3.29 倍，远高于 pTT8 类型质粒 pSN2 的 0.79 倍。这表明 pIOK 质粒在 *T. thermophilus* 中具有较高的复制效率。尽管这些质粒在 *E. coli* 中的拷贝数较低，但这一差异可能与不同宿主细胞的基因组结构和复制机制有关，需要进一步研究以明确其具体原因。

### 多质粒系统的应用实例

为了验证多质粒系统的功能，研究人员利用 pIOK 和 pSN 系列穿梭载体，将 *T. brockianus* SNM4-1 中的木聚糖利用通路基因分为两部分，并分别克隆到 pIOK3 和 pSN2K 载体中，构建了 pIOK3_B2 和 pSN2K_C2。通过在不含抗生素的培养基中培养这些重组菌株，研究人员发现只有同时携带两部分基因的菌株（HB27_BC）能够在木聚糖作为唯一碳源的条件下生长，而仅携带其中一部分基因的菌株则无法利用木聚糖。这一结果表明，通过多质粒系统可以成功重建完整的木聚糖利用通路，为合成生物学研究提供了重要的实验依据。

### 实验方法与技术细节

在实验过程中，研究人员采用了多种分子生物学技术，包括 PCR、Gibson 组装、质粒纯化和 DNA 测序等。为了确保实验的准确性，所有构建的质粒均通过 DNA 测序进行了验证。此外，为了评估质粒的拷贝数，研究人员使用了 KAPA SYBR Fast qPCR 试剂盒，并通过标准曲线计算了 DNA 的含量。这些方法的结合使得实验结果更加可靠，同时也为后续研究提供了技术参考。

### 实验结果的分析与意义

实验结果显示，pIOK 系列质粒在 *T. thermophilus* 中表现出较高的复制稳定性和兼容性，能够有效维持在不同培养条件下。特别是那些携带毒素-抗毒素模块的质粒，如 pIOK1 和 pIOK9，显示出显著的持久性，能够在无抗生素的环境中保持不丢失。这一发现对于合成生物学研究具有重要意义，因为它提供了一种无需抗生素即可维持质粒稳定性的方法，从而简化了实验操作并提高了研究的灵活性。此外，通过将大基因片段拆分为两部分并分别克隆到不同的质粒中，研究人员成功重建了木聚糖利用通路，证明了多质粒系统在功能基因组学中的应用潜力。

### 结论与展望

本研究通过基因组分析和实验验证，构建了一系列新型的 *T. thermophilus–E. coli* 穿梭载体 pIOK，并发现了毒素-抗毒素模块对质粒稳定性的增强作用。这些质粒不仅与传统的 pTT8 类型质粒兼容，还能够在不同培养条件下维持较高的拷贝数。通过将大基因片段拆分为两部分并分别克隆到不同的质粒中，研究人员成功实现了木聚糖利用通路的功能重建，展示了多质粒系统在合成生物学中的广泛应用前景。未来，这些质粒和毒素-抗毒素模块有望成为研究嗜热菌基因组和代谢途径的重要工具，推动该领域的进一步发展。