通过理性工程改造谷氨酸棒状杆菌以实现L-谷氨酰胺的生物合成

《Biochemical Engineering Journal》：Rational Engineering of Corynebacterium glutamicum for L-Glutamine Biosynthesis

　　L-Gln产量通过代谢工程策略提升至58.96 g/L，包括CRISPR/Cas12a敲除、异源GS筛选、RBS优化、sRNA抑制glnE、定点突变GS及动态调控ODHC。

　　L-谷氨酰胺（L-Gln）是一种重要的氨基酸，广泛应用于医药、功能性食品和动物饲料等行业。近年来，随着对L-Gln需求的不断增长，微生物发酵成为其工业化生产的主要手段。L-Gln的生物合成途径中，谷氨酰胺合成酶（GS）作为关键酶，负责将L-谷氨酸（L-Glu）转化为L-Gln。然而，GS的活性受到可逆的腺苷酰化调控，这种调控机制在一定程度上限制了L-Gln的产量。因此，如何有效调控GS的腺苷酰化状态，从而提升其催化效率，成为提高L-Gln产量的关键问题。

本研究通过多种代谢工程技术，对L-Gln的生产菌株进行了优化，最终成功构建出高效生产L-Gln的工程菌株CG17。该菌株在5升的补料分批发酵罐中，实现了高达58.96克/升的L-Gln产量，同时达到了0.31克/克葡萄糖的产率和1.05克/升/小时的生产效率。这一成果不仅展示了代谢工程在氨基酸合成中的巨大潜力，也为工业级发酵工艺的优化提供了新的思路。

在研究过程中，首先筛选了四种不同的Corynebacterium glutamicum菌株（ATCC 13032、ATCC 13809、s026和s9114），以确定最适合L-Gln生产的底盘菌株。通过对这些菌株进行摇瓶发酵实验，发现它们均能积累一定量的L-Glu，但L-Gln的产量相对较低。这表明，虽然这些菌株具备一定的代谢能力，但在L-Gln合成路径上仍存在一定的瓶颈。因此，需要通过基因编辑技术对关键代谢节点进行调控，以提高L-Gln的产量。

为了优化碳代谢流，研究团队采用CRISPR/Cas12a系统对C. glutamicum的γ-谷氨酰激酶基因进行了敲除。γ-谷氨酰激酶是L-Gln合成路径中的一个关键酶，其活性会消耗大量能量，从而影响整个代谢流的分配。通过删除该基因，可以将更多的碳代谢流导向L-Gln的合成路径，从而提高其产量。在这一策略下，L-Gln的产量从4.7克/升提升至5.3克/升，显示出初步的优化效果。

接下来，研究团队进一步筛选了多种来源的GS，并发现来源于Saccharomyces cerevisiae的GS具有最佳的催化活性。这一发现为L-Gln的高效合成提供了新的基因资源。为了进一步提升GS的表达水平，研究团队对GS的启动子进行了优化，特别是对核糖体结合位点（RBS）进行了工程改造，以增强翻译效率。通过这一策略，L-Gln的产量进一步提升至14.62克/升，显示出基因表达调控在提高产量中的重要作用。

为了进一步缓解GS的腺苷酰化抑制，研究团队采用了一种双重策略，包括定点突变和小RNA介导的抑制。通过对GS进行定点突变，研究团队消除了其表面的腺苷酰化位点，从而降低了腺苷酰化对GS活性的抑制作用。同时，利用小RNA技术抑制腺苷酰转移酶（glnE）的翻译，进一步削弱了腺苷酰化过程。这一策略显著提高了GS的活性，使得L-Gln的产量提升至19.06克/升，显示出对关键代谢节点的精细调控能够有效突破产量瓶颈。

在进一步优化代谢流的过程中，研究团队引入了一种“拉推”策略，即通过增强谷氨酸脱氢酶（gdh）的活性来增加L-Glu的前体供应，同时通过敲除谷氨酸合成酶（gltB）和谷氨酰胺酶（glnA）基因，阻断L-Gln的降解途径。这一策略有效地将代谢流集中到L-Gln的合成路径上，使得L-Gln的产量进一步提升至28.51克/升。此外，研究团队还利用了生长响应型启动子Pcg2705，该启动子在细胞处于稳定期时能够下调α-酮戊二酸脱氢酶（ODHC）的表达，从而减少L-Glu的消耗，提高其在细胞内的积累，最终使得L-Gln的产量达到31.85克/升。

在工程菌株CG17的构建过程中，研究团队还注重了菌株的生长特性和代谢平衡。通过引入生长响应型启动子，研究团队实现了对关键代谢基因表达的动态调控，从而在不同生长阶段优化代谢流分配。这种动态调控策略不仅有助于提高L-Gln的产量，还能够维持菌株的正常生长，避免因过度代谢而导致的细胞自溶或代谢紊乱。此外，研究团队还对其他关键代谢节点进行了优化，如通过小RNA技术抑制竞争性代谢途径中的关键酶，从而减少对L-Gln合成路径的干扰。

在实际应用中，研究团队将CG17菌株应用于5升的补料分批发酵罐中，实现了高达58.96克/升的L-Gln产量。这一结果不仅远超传统发酵方法的产量，也显示出该工程菌株在工业规模生产中的巨大潜力。通过优化碳代谢流、增强前体供应、阻断降解途径以及实现动态调控，研究团队成功构建出一个高效、稳定的L-Gln生产系统，为未来氨基酸生物合成的工业化应用奠定了坚实的基础。

本研究的创新点在于首次将小RNA干扰技术与定点突变技术相结合，以实现对GS活性的精细调控。这种“拉推”策略不仅能够有效提升L-Gln的产量，还能够避免传统基因敲除方法可能带来的代谢紊乱问题。此外，研究团队还探索了多种生长响应型启动子的应用，为实现动态代谢调控提供了新的工具。这些策略的综合应用，使得L-Gln的合成效率得到了显著提升，同时保持了菌株的稳定性和生长能力。

在工业应用方面，L-Gln的高效生产不仅能够降低生产成本，还能够减少对环境的污染，符合当前可持续发展的趋势。此外，L-Gln作为一种重要的氨基酸，其在医药、食品和饲料等领域的应用前景广阔。例如，在医药领域，L-Gln被广泛用于营养补充剂和药物辅料；在食品领域，它被用于增强食品的营养价值和风味；在饲料领域，它则被用作动物饲料的添加剂，以提高动物的生长性能和健康水平。因此，提升L-Gln的产量和生产效率，不仅有助于满足市场需求，还能够推动相关产业的发展。

本研究的成果表明，通过系统性的代谢工程策略，可以有效优化微生物的代谢路径，提高目标产物的产量。这为其他氨基酸的生物合成提供了可借鉴的模式。未来，随着合成生物学技术的不断发展，类似的策略可以应用于其他氨基酸的生产，如L-赖氨酸、L-色氨酸等，从而实现多种氨基酸的高效合成。此外，研究团队还提出了进一步优化的方向，如探索更多类型的启动子和小RNA调控元件，以实现更精细的代谢调控。

总之，本研究通过一系列创新性的代谢工程策略，成功构建出高效生产L-Gln的工程菌株CG17。该菌株在5升的补料分批发酵罐中实现了高达58.96克/升的L-Gln产量，显示出在工业生产中的巨大潜力。研究团队的成果不仅为L-Gln的工业化生产提供了新的解决方案，也为其他氨基酸的生物合成研究提供了重要的参考。随着相关技术的不断进步，未来有望实现更高产量、更低成本的氨基酸生产，进一步推动生物制造技术的发展。