生命早期激素环境对海马小胶质细胞形态和转录组学性别差异的组织作用及其终身影响

《Botany》：Sex differences in microglia morphology and function across the lifespan are mediated by the early hormone environment

　　本文揭示了生命早期激素环境对海马小胶质细胞性别二态性的组织作用。研究发现，新生期睾酮（testosterone）处理可“雄性化”雌性大鼠小胶质细胞形态，并使其在衰老期呈现促炎性转录组特征；而雄激素受体拮抗剂氟他胺（flutamide）处理对雄性大鼠影响相对有限。该研究强调了围产期激素在塑造神经免疫系统终身性别差异中的关键作用，为理解神经精神疾病和神经退行性病变的性别偏倚提供了新视角。

　　

1. 1.
   引言

众多神经系统疾病在发病率、表现或进展上存在性别偏倚。例如，自闭症谱系障碍（ASD）、精神分裂症和学习障碍等神经发育障碍在男性中更常见，而抑郁症、焦虑症等情绪障碍以及阿尔茨海默病等神经退行性疾病在女性中更为普遍。免疫系统参与了许多此类神经系统疾病的病理生理过程，这引发了人们对大脑免疫系统性别差异日益增长的兴趣。虽然神经元和星形胶质细胞等某些胶质细胞群的性别差异已得到很好的表征，但导致小胶质细胞性别差异的机制尚未完全阐明。

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）的常驻免疫活性细胞，负责监测大脑以发现损伤或炎症迹象。在病理条件下，小胶质细胞经历形态和功能的快速变化：反应性小胶质细胞缩回其分支状突起，形成圆形的阿米巴样细胞，参与吞噬作用并产生促炎分子。小胶质细胞起源于卵黄囊的髓系前体细胞，在啮齿类动物胚胎第8-9天（E8–9）血脑屏障形成之前浸润神经管。小胶质细胞在健康的大脑发育和功能中扮演关键角色，包括轴突导向、突触修剪和神经突生长，并且是大脑性别分化的必要条件。在出生后的最初几天，小胶质细胞开始出现性别差异。早在出生后第2天（P2），雄性就表现出更多的阿米巴样小胶质细胞。然而，到青春期（P30），雌性拥有更多的阿米巴样小胶质细胞，这种效应持续到成年期甚至老年动物。小胶质细胞活动的性别差异也存在，包括吞噬能力、抗原呈递和细胞因子产生。此外，在培养的新生小胶质细胞中加入类固醇激素雌二醇（E₂）对雄性和雌性有不同的影响：E₂增加雌性小胶质细胞促炎细胞因子的释放，但减少雄性细胞因子的释放，这突出了激素在协调小胶质细胞活动中的作用。

发育中的性别差异源于遗传和/或激素因素。性腺产生的类固醇激素在围产期发育的敏感期驱动性别分化并影响大脑。这种关于激素如何影响大脑发育的理解，即组织/激活假说，首先确定性别差异是否由围产期激素所组织，然后进一步确定这种性别差异是否在成年期由青春期涌入的性腺激素维持或激活。在啮齿类动物中，主要的信号激素是来自产前睾丸的雄激素睾酮，它在胚胎期结束时达到峰值，然后在生命的第一天迅速下降。这种早期的类固醇暴露调节了某些胶质细胞群（如星形胶质细胞和小胶质细胞）形态和活动的性别差异。

早期类固醇暴露对小胶质细胞形态和功能的性别差异在整个生命周期中的作用尚未得到评估。有几项研究考察了类固醇激素如何影响小胶质细胞功能，但这些研究通常在成年期检查激素暴露，或在培养中检查小胶质细胞功能，并且并不总是跨性别进行比较。其他工作评估了类固醇激素的组织效应对幼年期或年轻成年期小胶质细胞的影响。有趣的是，我们实验室先前的研究表明，在衰老过程中操纵激素浓度并不影响小胶质细胞功能的性别差异，这表明发育期的激素暴露可能是决定小胶质细胞性别特异性命运的关键因素。因此，本研究旨在探讨早期围产期激素环境对小胶质细胞形态和功能在整个生命周期中的影响。我们假设在生命早期接受睾酮丙酸盐治疗的雌性个体，其小胶质细胞生理在整个生命周期中会发生改变，呈现出更“雄性化”的小胶质细胞表现。

1. 2.
   方法

2.1. 动物

雌性F344大鼠与雄性Brown Norway大鼠交配，基于美国国家老龄化研究所F344xBN群体的指导原则，作为一种健康的、非神经退行性变的衰老模型。幼崽在出生后第0天（P0）断奶，并与同窝同性别的幼崽配对饲养。在三个不同的生命周期阶段处死大鼠：青春期（P30）、成年期（P150）和老年期（P700）。在上午9点使用安乐死III溶液（戊巴比妥钠和苯妥英钠）过量注射处死大鼠。一旦无反应，从右心房采集心脏血用于激素检测，然后用冰盐水经心脏灌注。

2.2. 激素处理

在生命的最初两天（P0和P1），所有幼崽接受每日皮下注射。雌性幼崽接受芝麻油或溶于0.1毫升芝麻油载体的150微克丙酸睾酮（～25毫克/千克）；雄性幼崽接受芝麻油或溶于0.1毫升芝麻油载体的250微克雄激素拮抗剂氟他胺（～50毫克/千克）。这些剂量在生命最初两天给药足以改变雄性和雌性的性别分化。

2.3. 免疫组织化学和分析

盐水灌注后立即取出大脑并分半。一半大脑在4%多聚甲醛中后固定过夜，然后在30%蔗糖中 cryoprotected，并使用异戊烷（约-55°C）冷冻。大脑用冷冻切片机以18微米厚度切片，安装在Superfrost Plus载玻片上，储存于-20°C。进行免疫组织化学染色，使用兔抗IBA1（1:1000）一抗孵育48小时，然后使用Alexa Flour 488标记的羊抗兔IgG（1:500）二抗孵育2小时，最后用Hoechst33342（1:10,000）复染。使用Olympus FV3000共聚焦显微镜在20倍下拍摄小胶质细胞计数图像，在60倍下拍摄小胶质细胞形态图像。对背侧海马体的每个区域（CA1、齿状回）拍摄3张图像，报告的数据是这3张图像的平均值。使用Imaris Bitplane软件进行半自动分析，评估IBA1阳性细胞计数、小胶质细胞胞体大小和球形度、小胶质细胞树突分支点、树突面积、树突长度以及Sholl分析。每个脑区分析6个小胶质细胞，并在动物内取平均值以容纳小胶质细胞形态的个体内差异。

2.4. 小胶质细胞分离和离体炎症刺激

盐水灌注后，使用Percoll密度梯度法从半脑分离小胶质细胞。分离的小胶质细胞重悬于含10%胎牛血清的DMEM中。使用血球计数板计数细胞，并用台盼蓝鉴定死细胞。将细胞密度调整至10,000个细胞/90微升，将90微升细胞接种在96孔V底板中。为了评估小胶质细胞的炎症反应，细胞与不同浓度的脂多糖（LPS）孵育3小时。

2.5. 激素检测

在三个时间点采集心脏血，离心分离血清后储存于-80°C。使用超灵敏雌二醇放射免疫分析法（RIA）检测雌性血清雌二醇浓度。使用睾酮双抗体RIA检测雄性血清睾酮浓度。

2.6. Tag-sequencing

从P700的速冻海马组织中提取RNA。将RNA提交至测序核心进行3'UTR偏向性转录组测序（Tag-seq），使用NovaSeq 6000 SR100测序仪进行测序。使用Linux计算服务器，对FASTQ文件进行修剪，并将读数比对到mRatBN7.2基因组。使用HTseq量化原始计数。使用limma R包进行差异表达分析，并进行1000次排列分析以估计经验错误发现率（eFDR）。差异表达基因（DEG）定义为eFDR为5%，调整后p值（p.adj）<0.05，且绝对log2倍数变化≥0.2（即表达量变化约15%）的基因。使用clusterProfiler对p值≤0.05的基因进行基因集富集分析。

2.7. 统计分析

使用Graphpad Prism 10和Rstudio分析数据。所有数据均以平均值±SEM表示。鉴于雄性和雌性的激素处理不同，我们选择分别分析性别，并在适当时仅比较跨性别的油处理对照组。统计分析包括双向方差分析（ANOVA）。如果检测到显著的交互作用，则进行事后检验，并使用Tukey校正调整p值。所有检验的α值设定为0.05。

1. 3.
   结果

3.1. 生命早期激素处理改变雌性体重增加和雄性睾丸大小

为了确定生命早期激素环境是否是小胶质细胞形态性别差异出现所必需的，在生命最初两天对幼鼠进行类固醇激素处理（雄性用氟他胺，雌性用睾酮）。平均窝产仔数为10.06±0.57，雄性和雌性分布均匀。在所有时间点，所有动物的体重都随着年龄增长而增加。激素处理影响雌性而非雄性大鼠的体重增加。事实上，氟他胺处理并未影响雄性在任何年龄的体重。在雌性中，睾酮处理在青春期后增加了体重增益。

激素处理影响了两性初级性征的出现，但仅影响雄性的激素浓度。激素操作并未改变任一性别的肛门生殖器距离（AGD）。AGD随着所有动物的年龄增长而增加，与处理无关。然而，雄性中早期的氟他胺处理增加了总睾丸重量以及睾丸与体重的比率。总睾丸重量随年龄显著增加，尽管只有接受氟他胺处理的雄性在老年时睾丸显著重于成年雄性。与睾丸重量增加一致，生命早期的氟他胺处理也增加了成年血清中的睾酮浓度水平。成年雄性，无论处理如何，其睾酮浓度均高于青春期前或老年大鼠。相反，雌性中的睾酮处理并未影响子宫角重量或血清雌二醇浓度。然而，睾酮处理改变了雌性的阴道形态，阻止了成年和老年雌性阴道口的出现。总之，这些结果表明生命早期的激素处理改变了雄性和雌性的初级性征，但仅改变了雄性的激素血清水平。

3.2. 生命早期激素操作改变老年小胶质细胞的离体细胞因子产生

为了评估小胶质细胞反应性的性别差异，在每个发育时间点从雄性和雌性大脑中提取小胶质细胞。用不同剂量的LPS离体刺激从半脑分离的小胶质细胞，以评估细胞因子产生的性别差异。与之前在海马分离的小胶质细胞中的工作相反，在成年或老年小胶质细胞中未检测到雄性和雌性在IL1β mRNA表达上的差异。雄性中的氟他胺处理不影响成年或老年小胶质细胞中LPS引发的Il1β mRNA表达。成年雌性小胶质细胞的IL6 mRNA表达低于雄性，这种效应在老年小胶质细胞中未见。雄性中的氟他胺处理不影响成年雄性小胶质细胞的IL6基因表达。然而，在从老年雄性分离的小胶质细胞中，早期氟他胺处理降低了IL6 mRNA表达。这些结果表明，早期产后氟他胺处理可能会减少雄性中与年龄相关的炎症变化。

在雌性中，早期产后睾酮处理并未改变成年小胶质细胞中LPS引发的IL1β mRNA表达，但确实降低了从老年雌性分离的小胶质细胞中的Il1β mRNA表达。睾酮处理不影响雌性成年或老年小胶质细胞的IL6 mRNA水平。还评估了青春期小胶质细胞IL1β和IL6基因表达的性别差异。在青春期小胶质细胞细胞因子产生中未检测到性别差异，在早期生命中使用氟他胺或睾酮处理的青春期小胶质细胞中也未检测到。总体而言，我们报告了LPS引发的促炎细胞因子基因表达存在细微的性别差异。任一性别的早期激素处理并未减少这些细微的性别差异，可能是由于不同脑区表达水平的对比所致。

3.3. 小胶质细胞形态年龄相关变化的性别差异

为了评估小胶质细胞形态的性别差异，对青春期、成年和老年大脑的CA1和齿状回（DG）的油处理雄性和雌性进行了IHC。虽然性别不影响CA1中的小胶质细胞计数，但雌性在DG中的小胶质细胞数量有少于雄性的趋势，尽管不具统计学显著性。在CA1中，性别之间在小胶质细胞胞体面积或Iba1强度方面未观察到差异，尽管衰老（独立于性别）增加了小胶质细胞胞体面积，并趋向于降低Iba1胞体强度。在DG中，雌性而非雄性显示出与年龄相关的胞体面积变化。与成年动物相比，老年雌性的小胶质细胞胞体面积增加，这种效应在雄性中未见。DG中的小胶质细胞Iba1胞体强度不受性别影响，尽管有随着年龄增长Iba1强度降低的趋势。

为了进一步检查小胶质细胞形态的性别差异，进行了Sholl分析以表征小胶质细胞分支复杂性。分支形态被认为是小胶质细胞反应状态的代理：监视性小胶质细胞表现出长的突起，在病理或炎症条件下会缩回以采用更接近阿米巴的形态。还评估了分支复杂性的其他指标，如分支点数量、丝状面积和树突长度。所有动物，无论性别，都显示出小胶质细胞分支因衰老而发生的特征性变化。在青春期早期，CA1和DG中的小胶质细胞都具有远离胞体的长突起。这些分支在成年期缩回，在胞体附近变得更加复杂。为了进一步表征小胶质细胞分支的性别差异，计算了CA1和DG中Sholl分析的曲线下面积（AUC）。在CA1中，性别差异仅在成年期观察到，当时雄性比雌性具有更大的AUC。所有动物，无论性别，在CA1中老年小胶质细胞的AUC（因此分支减少）均低于青春期和成年小胶质细胞。衰老还减少了两性CA1和DG中小胶质细胞的分支点、小胶质细胞丝状面积和总小胶质细胞树突长度。

在齿状回中，小胶质细胞分支的性别差异在青春期就已出现并持续存在。早在P30，油处理雄性小鼠的小胶质细胞就比雌性具有更大的分支复杂性，这种效应持续到成年期。虽然雄性中的氟他胺处理不影响青春期的小胶质细胞分支，但雌性中的睾酮处理增加了分支，导致更雄性化的形态。在成年期，氟他胺和睾酮都改变了小胶质细胞形态。早期用氟他胺处理的成年雄性减少了小胶质细胞分支，呈现更雌性化的形态，而早期用睾酮处理的雌性增加了小胶质细胞分支，呈现更雄性化的形态。

DG中的小胶质细胞显示出与CA1中相同的老年小胶质细胞性别差异。油处理雄性在青春期和成年海马体中的分支相对于雌性更多，但在老年组织中减少分支，呈现更接近阿米巴的形态，相对于雌性。与年轻小胶质细胞的分支效应相反，早期氟他胺和睾酮在老年小胶质细胞中具有相反的效果。在老年雄性中，早期氟他胺增加了分支，呈现更雌性化的表型，显示出与成年雄性相反的效果。相反，早期睾酮处理的老年雌性减少了小胶质细胞分支，呈现雄性化表型，而睾酮处理先前在青春期小胶质细胞中增加了分支。总之，我们证明在青春期和成年动物中，雄性小胶质细胞相对于雌性显示出增加的分支，这种效应在衰老过程中发生逆转。生命最初两天的激素处理足以重现整个生命周期中存在的这些性别差异。

3.4. 生命早期睾酮处理雄性化雌性CA1区小胶质细胞形态

为了确定生命早期激素处理是否对小胶质细胞形态产生持久影响，我们对青春期、成年和老年雄性和雌性大鼠海马CA1组织进行了IHC，这些大鼠在生命早期接受了激素处理，并评估了计数、胞体特征和Sholl分析作为小胶质细胞活性的指标。生命早期激素处理或衰老不影响雄性或多雌性的小胶质细胞计数，与油处理动物的证据一致。衰老，无论激素处理如何，趋向于改变雌性大鼠的小胶质细胞计数，尽管不具有统计学显著性。

小胶质细胞胞体大小被评估为小胶质细胞反应性的指标，因为在炎症条件下会形成更大的胞体大小。正如预期的那样，衰老增加了雄性和雌性的胞体大小，无论早期激素处理如何。激素处理不影响任一性别的胞体大小，与油处理对照的证据一致。

衰老导致雄性和雌性的Iba1强度降低。尽管老年大脑中Iba1强度降低，但在所有时间点都很容易区分胞体形态。激素处理不影响任一种性的Iba1强度。总之，生命早期的激素处理在任何年龄的CA1中都不影响小胶质细胞胞体形态，这与对照组性别间小胶质细胞胞体形态无差异的证据一致。

使用一系列形态学指标评估小胶质细胞分支复杂性的变化，包括分支点数量、丝状面积、树突长度和Sholl分析。CA1中油对照组之间的性别差异在青春期不存在，但出现在成年和老年小胶质细胞中。在成年CA1小胶质细胞中，雄性对照比雌性对照具有更复杂的分支，这种效应在衰老过程中发生逆转，因此老年雌性对照比雄性显示出更多的分支。雄性早期的氟他胺处理不改变青春期CA1的小胶质细胞形态，但确实减少了成年雄性的分支，呈现更雌性化的形态。在老年动物中，氟他胺具有相反的效果：增加老年CA1的分支，呈现更雌性化的形态。在雌性中，睾酮处理增加了青春期和成年雌性的小胶质细胞分支，表明睾酮有效地雄性化了雌性小胶质细胞。在老年雌性中，早期激素处理没有影响，这可能与年龄相关的小胶质细胞分支变化的性别差异有关。睾酮处理在所有年龄段的CA1中也趋向于增加小胶质细胞丝状面积，并增加了处理雌性的树突长度，与年龄无关。因此，生命早期的睾酮处理增加了成年雌性海马体的小胶质细胞分支，使其在青春期和成年期呈现更“雄性化”的表型，而生命早期的氟他胺处理减少了成年雄性的小胶质细胞分支，并增加了老年雄性的分支，使其呈现更雌性化的形态。

3.5. DG中性别特异性小胶质细胞分支通过生命早期激素处理重现

还评估了DG中小胶质细胞形态的变化，以确定生命早期激素处理是否对小胶质细胞反应性产生区域特异性效应。衰老增加了雄性和雌性的小胶质细胞计数。氟他胺处理导致成年时小胶质细胞计数短暂减少，与对照组雌性小胶质细胞计数有减少趋势的证据一致。激素处理不影响雌性DG中的小胶质细胞计数。衰老增加了雌性而非雄性（无论激素处理如何）的小胶质细胞胞体面积，模仿了老年对照雌性而非老年对照雄性胞体面积的增加。激素处理不影响任一种性的小胶质细胞胞体大小。两性都出现了与年龄相关的Iba1强度变化：雄性和雌性随着年龄增长，小胶质细胞胞体中的Iba1强度降低。激素处理不影响任一种性的Iba1强度。总之，我们报告了DG中与CA1中相似的年龄相关变化，并且生命早期的激素处理也不影响DG中的小胶质细胞胞体形态，正如在CA1中报道的那样。

使用Sholl分析评估的DG中小胶质细胞分支揭示了在青春期出现并持续存在的性别差异。早在P30，油处理雄性小鼠的小胶质细胞就比雌性具有更大的分支复杂性，这种效应持续到成年期。虽然氟他胺处理不影响雄性青春期的小胶质细胞分支，但雌性中的睾酮处理增加了分支，导致更雄性化的形态。在成年期，氟他胺和睾酮都改变了小胶质细胞形态。早期用氟他胺处理的成年雄性减少了小胶质细胞分支，呈现更雌性化的形态，而早期用睾酮处理的雌性增加了小胶质细胞分支，呈现更雄性化的形态。

DG中的小胶质细胞显示出与CA1中相同的老年小胶质细胞性别差异。油处理雄性在青春期和成年小胶质细胞中比雌性显示出更大的分支，但在老年组织中减少分支，呈现更接近阿米巴的形态，相对于雌性。与这种分支性别差异的逆转一致，早期氟他胺和睾酮在老年小胶质细胞中具有与年轻小胶质细胞相反的效果。在老年雄性中，早期氟他胺增加了分支，呈现更雌性化的表型，显示出与成年雄性相反的效果。相反，早期睾酮处理的老年雌性减少了小胶质细胞分支，呈现雄性化表型，而睾酮处理先前在青春期小胶质细胞中增加了分支。总之，我们证明在青春期和成年动物中，雄性小胶质细胞相对于雌性显示出增加的分支，这种效应在衰老过程中发生逆转。生命最初两天的激素处理足以重现整个生命周期中存在的这些性别差异。

3.6. 生命早期激素处理导致老年海马转录组谱的性别特异性变化

为了评估生命早期激素处理是否影响海马基因表达的更广泛变化，包括小胶质细胞相关的转录变化，对老年海马组织进行了Tag-seq测序。测序数据与Rattus norvegicus基因组的平均比对效率为90.5±0.09%。为了确定老年海马组织中的性别差异以及生命早期激素的影响，进行了三次比较：雄性对照与雌性对照，雄性对照与氟他胺处理的雄性，雌性对照与睾酮处理的雌性。在所有三次比较中分析了总共12,608个基因。

当比较老年雄性和雌性对照时，541个DEGs显示转录组谱存在性别差异。与老年雄性对照相比，295个基因在老年雌性对照中上调，而246个基因在雄性对照中表达更高。我们还对差异表达最显著的基因进行了KEGG通路分析，以更好地理解生物过程的广泛变化。与雌性相比，对照老年雄性在蛋白质吸收和消化（例如Ace2, Col8a1, Col8a2, Kcnj13, Mme）、肝炎和细胞粘附（例如Cd63, Cd9, Scarb1）以及补体级联反应（例如A2m, C2, F5, F3, C8g, Masp1, Serping1）相关基因上表达更高，表明老年雄性相比雌性炎症通路发生变化。

还分别分析了老年雄性和雌性，以比较新生儿激素处理如何影响基因表达。雄性中早期氟他胺处理导致355个DEGs，其中223个在雄性油组中相对于雄性氟他胺组上调，132个在氟他胺处理的雄性中相对于油对照组上调。KEGG通路分析显示，与氟他胺处理的雄性相比，雄性油组中与蛋白质消化（例如Ace2, Col3a1, Col8a1, Col8a2）相关的基因表达类似地上调，表明早期氟他胺改变了蛋白质消化基因表达，其方向与对照雌性相同。此外，一些与肝炎相关的基因，如那些参与紧密连接形成的基因（例如Cldn1, Cldn2, Ocln），在对照雄性中相对于氟他胺雄性也上调，重现了老年对照中观察到的基因表达性别差异。在老年雌性中，睾酮处理导致493个DEGs。在这些DEGs中，246个在油雌性中相对于睾酮处理组上调，247个下调。KEGG通路分析显示，雌性中早期睾酮处理增加了与蛋白质吸收和消化（Ace2, Col1a2, Col8a1, Kcnj13, Kcnq1）、肝炎（例如Cd63, Cd