CRISPR/Cas9介导的epsA基因敲除证实了其在乳酸菌外多糖合成中的关键作用

《Food Bioscience》：CRISPR/Cas9-mediated knockout of epsA validates its key role in exopolysaccharide production of lactic acid bacteria

　　本研究以新疆传统发酵乳制品中分离的三株高产胞外多糖（EPS）乳酸菌为对象，通过全基因组测序和比较基因组分析，发现epsA基因是调控EPS合成的关键基因。采用CRISPR/Cas9技术敲除该基因后，EPS产量显著降低，证实其重要性。研究结果为乳酸菌EPS高产菌株的筛选和遗传改良提供了理论依据。

　　

赖江|胡彦舒|龚伟|穆光清|姜书娟

大连工业大学食品科学与技术学院，中国大连，116034

摘要

乳酸菌（LAB）的外多糖（EPS）是一种具有益生菌功能的天然多糖。目前，对于高EPS产量的关键调控基因的精确鉴定仍然有限。本研究使用了从新疆传统发酵乳制品中分离出的三种高EPS产量的菌株：Lactiplantibacillus plantarum F179、Lactiplantibacillus plantarum DPUL610和Lacticaseibacillus paracasei DPUL35-2-12，其EPS产量分别为463.35 mg/L、388.94 mg/L和364.75 mg/L。首先，对这三种菌株的全基因组进行了测序和注释。结果揭示了这三种菌株具有强大的碳水化合物和氨基酸代谢能力。此外，还绘制并比较了这三种菌株的EPS基因簇与其他菌株的EPS基因簇，从而提出epsA基因是EPS产生的关键调控基因的假设。通过CRISPR/Cas9技术成功构建了高产量菌株L. plantarum F179的epsA敲除突变体。该突变体L. plantarum F179ΔepsA表现出epsA表达完全缺失，导致EPS产量减少了21.99%，生物膜形成减少了30.02%。这些结果表明epsA基因对EPS生物合成有显著贡献，可能是影响乳酸菌高EPS产量的关键基因之一。这些发现为通过基因调控EPS合成来改良菌株提供了理论基础，并为高通量筛选高产量EPS产生乳酸菌提供了有价值的指导。

引言

随着对乳酸菌（LAB）功能特性的了解不断深入，人们对其外多糖（EPS）的关注也日益增加，EPS是一类与益生菌功能相关的关键代谢物（Hussein等人，2024年）。EPS可以进一步分为两类：同聚糖（HoPS），由三种或更多相同的单糖组成；异聚糖（HePS），由3-8种不同的单糖、单糖衍生物或取代单糖组成的重复结构单元构成（Badel等人，2011年；Saadat等人，2019年）。乳酸菌EPS表现出多种功能特性。研究表明，Bifidobacterium longum YS108R分泌的EPS可以调节肠道微生物群平衡，增加小鼠肠道中的短链脂肪酸（SCFA）水平，并抑制有害细菌的增殖（Badel等人，2011年）。此外，实验室研究表明，乳酸菌EPS还具有免疫调节作用、抗氧化活性、抗肿瘤特性和抗病毒功能（Andrew & Jayaraman，2020年；Biliayska等人，2019年；Kudo等人，2024年；Sun等人，2021年）。近年来，随着EPS功能特性的不断探索，其应用范围也显著扩大（Hussein等人，2025年）。在乳制品工业中，EPS通过氢键和疏水相互作用形成三维网络，改善了发酵乳的质地和保水能力（Daba等人，2021年）。在烘焙领域，EPS由于其多孔网络结构和刚性链配置，增强了面团的粘度和保水性（Caggianiello等人，2016年）。此外，EPS在食品保存方面也有潜在应用。例如，将其作为水果表面的涂层时，可以显著降低褐变指数并抑制霉菌生长（Wu等人，2024年）。尽管EPS具有这些有益的功能特性，但由于产量低和生产成本高，目前尚未实现乳酸菌EPS的工业化生产。目前提高EPS产量的策略主要集中在优化培养条件上，但这种方法存在显著局限性。因此，探索新的方法（如比较基因组分析和基因编辑）来调控乳酸菌中的EPS合成至关重要。

基因组学是研究与表型特征相关的遗传变异的强大工具。由于乳酸菌具有重要的功能特性、益生菌价值及广泛的应用潜力，最近的研究利用基因组学分析来阐明其功能特性的分子机制。这种方法提高了筛选效率并加速了工业应用（Wu等人，2017年）。例如，张等人通过比较不同Bifidobacterium longum菌株的基因组分析，发现abfA基因簇对于缓解人类肠道功能性便秘至关重要（Zhang等人，2023年）。同样，吴等人（2024年）开发了一种名为metaProbiotics的语言模型，用于分析肠道微生物群基因组以识别潜在的益生菌菌株。

研究表明，乳酸菌中的EPS生物合成受eps基因簇的调控，该基因簇通常包含15-25个基因。这些基因可以从功能上分为四组：编码转录调控蛋白的调控基因、负责前体单糖生产的糖核苷酸合成基因、催化单糖单元依次连接到脂质载体上的糖基转移酶基因、以及介导重复单元翻转、聚合和细胞外分泌的聚合和输出基因（Deo等人，2019年；Zeidan等人，2017年）。尽管对eps基因簇有相对全面的了解，但很少有研究确定细菌菌株高EPS产量的关键遗传决定因素。

本研究认为，可以通过基因组学方法识别出区分高EPS产量和低EPS产量菌株的关键基因，并通过遗传学方法进行验证。因此，对三种高EPS产量的乳酸菌菌株进行了比较基因组分析。这种方法揭示了遗传特征与EPS产量之间的关系，从而预测了参与EPS生物合成的关键基因。最终使用CRISPR-Cas9基因编辑技术对这些候选基因进行了研究和验证。在我们的研究中，对参与EPS生物合成的关键基因的精确定位为高通量快速筛选高产量EPS产生乳酸菌提供了有价值的指导。此外，本研究为通过遗传方法调控乳酸菌EPS生产提供了研究基础。

部分内容

菌株、培养基和生长条件

为了激活Lactiplantibacillus plantarum F179、Lactiplantibacillus plantarum DPUL610和Lacticaseibacillus paracasei DPUL35-2-12，将菌种以2%（v/v）的浓度接种到MRS培养基中，并在37°C下静态培养24小时。经过两代激活后，将菌种以2%（v/v）的浓度接种到含有5%蔗糖（w/v）碳源的MRS培养基中，并在37°C培养箱中培养24小时以筛选高EPS产量菌株。使用E. coli Top10作为

三种高产量EPS菌株的分类鉴定

在我们之前的研究中，从新疆地区的传统发酵乳制品中分离出了三种具有强EPS产生能力的乳酸菌菌株。这三种菌株F179、DPUL610和DPUL35-2-2的EPS产量分别为463.35 mg/L、388.94 mg/L和364.75 mg/L（图1A）。在Wang等人（2023年）的研究中，从人乳中分离出的一种L. fermentum MWLf-4菌株被认定为高胞外多糖产生菌，其产量为350.0 mg/L

结论

本研究通过对三种高EPS产量乳酸菌菌株进行全基因组测序和基因注释，发现这三种菌株都具有高效的碳水化合物和氨基酸代谢能力。比较基因组学和CRISPR/Cas9敲除实验表明epsA是乳酸菌中高外多糖产生的关键基因。预计本研究中鉴定出的负责EPS生物合成的关键基因的精确定位将为

CRediT作者贡献声明

穆光清：监督、资源提供。龚伟：方法学研究。胡彦舒：验证、监督。姜书娟：写作——审稿与编辑、软件使用、资源提供。赖江：写作——初稿撰写、项目管理、方法学研究、实验设计

未引用参考文献

Wu等人，2024年。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

利益冲突声明

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

本研究由中国国家重点研发计划（2022YFD2100701）资助。