通过β-木糖苷酶合成的木二糖异构体的制备型高效液相色谱纯化及其结构表征

《Food Chemistry》：Preparative high-performance liquid chromatography purification and structural characterization of xylobiose isomers synthesized by β-xylosidase

　　xylobiose异构体通过β-xylosid酶催化合成，并采用循环制备高效液相色谱法（HPLC）纯化，总产率为18.5%，分离出三种β-1,2-, β-1,3-, β-1,4-糖苷键连接的xylobiose异构体，纯度达85.6%-97.3%，验证了结构差异对肠道菌群Bifidobacterium的特异性促生长作用。

　　这项研究的核心在于通过β-xylosidase的反应合成木糖二糖异构体，并开发了一种预处理高效液相色谱（HPLC）分离方法以实现它们的纯化。研究人员通过逆向β-xylosidase反应，在50°C条件下使用6.68 M的木糖底物进行24小时的反应，成功获得了总木糖二糖产量的18.5%。随后，通过预处理HPLC分离技术，研究人员识别并纯化了三种不同的产物峰。通过对这些产物进行两次不同的单次循环纯化技术处理，每种木糖二糖异构体的纯度均被提升至超过95%。最终的纯度范围在85.6%到97.3%之间，回收率则在36.2%到75.2%之间。

木糖二糖异构体的分子量和连接结构通过液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）和核磁共振光谱（NMR）进行了分析。所有产物峰均显示出281.09 Da的分子量，这表明它们都是由两个木糖单元通过β-1,3-、β-1,2-或β-1,4-糖苷键连接而成的二糖。这些木糖二糖异构体在模拟消化过程中保持完整，并且能够刺激双歧杆菌（Bifidobacterium）菌株的生长。这一发现具有重要意义，因为这意味着这些异构体在肠道中不会被有害菌如大肠杆菌（E. coli）利用，而能够被有益菌优先分解，从而促进肠道环境的改善。

木糖二糖通常被描述为由两个木糖单元通过β-1,4糖苷键连接而成的结构，它是木糖寡糖（XOS）混合物中的主要成分之一，约占35%。木糖二糖的甜度约为蔗糖的30%，这使得它在食品工业中具有一定的应用潜力。研究表明，当肠道微生物将XOS作为碳源进行代谢时，木糖二糖通常与木糖三糖共同被利用。此外，木糖二糖对双歧杆菌具有显著的益生元效应，能够增强肠道内不可消化寡糖分解酶的活性，从而降低肠道pH值，为有益菌的生存创造有利环境。当纯化的木糖二糖作为碳源时，它在双歧杆菌（如B. adolescentis和L. plantarum）的培养中表现出更高的生长率和更低的pH值，相较于相同浓度的XOS。这表明木糖二糖在肠道中的代谢特性与XOS有所不同，能够更有效地支持有益菌的增殖。

值得注意的是，木糖二糖在肠道消化系统中通常不会被分解，这使得它能够作为一种稳定的益生元成分。在一项针对成年女性的研究中，木糖二糖作为7%的替代混合物被使用，结果显示它能够有效缓解便秘问题，促进双歧杆菌的增殖，并改善肠道环境。这些结果进一步支持了木糖二糖作为食品益生元材料的有效性。然而，尽管木糖二糖具有这些益生特性，但目前的研究主要集中在XOS的混合物上，而非基于其聚合度（DP）的特定寡糖的分离。因此，获取高纯度的木糖二糖对于生产高质量的食品益生元产品至关重要，因为低DP的XOS如木糖二糖和木糖三糖更易被有益肠道细菌利用。

传统的木糖二糖生产方法主要依赖于从植物细胞壁的木质纤维素基质中提取和分解木聚糖（xylan）。通常，经过高温蒸汽处理和酸溶液处理后，木聚糖会通过乙醇沉淀法进行提取。随后，木聚糖会通过木聚糖酶（xylanase）水解生成XOS，而为了获得纯化的木糖二糖，需要进一步的纯化步骤。这一过程涉及多个复杂的步骤，包括木聚糖提取和酶处理，不仅耗时，而且需要大量的能量和资金投入。因此，研究人员开始探索使用木糖作为原料直接合成木糖二糖的方法，这种方法相较于传统方法更为简便。

β-xylosidase（EC 3.2.1.37）是一种能够分解短链XOS并将其转化为木糖的酶。该酶的催化域包含两个底物结合亚基，使其能够在活性位点同时与两个木糖分子相互作用，从而促进糖苷键的形成。这种特性使得β-xylosidase在逆向水解反应中能够有效地催化木糖二糖的合成。研究发现，提高反应温度和增加底物浓度是推动β-xylosidase水解反应逆向进行的关键因素。例如，来自嗜热菌Sporotrichum thermophile的β-xylosidase在60%（w/v）的木糖浓度下能够显著促进木糖二糖的合成，而Aspergillus niger来源的β-xylosidase则在60%（w/v）的木糖浓度下获得了12%的木糖二糖转化率。此外，研究还发现除了β-1,4-木糖二糖外，β-1,1-、β-1,2-和β-1,3-连接的木糖二糖异构体也被成功合成。

由于目前大多数研究仍集中于XOS的混合物，而非基于其连接方式的特定寡糖分离，因此对于木糖二糖异构体的纯化技术仍存在一定的局限性。例如，通过内切木聚糖酶（endo-xylanase）处理木聚糖后，利用纳米过滤技术可以分离出纯度为90.1%、回收率为42.4%的木糖二糖。而通过在酵母S. cerevisiae中表达来自Bacillus pumilus的β-xylosidase，研究人员成功合成了木糖二糖及其异构体，其中一种异构体的纯度达到了98.2%，回收率则为80%。然而，现有的多步骤纯化方法仍然存在效率低、耗时长的问题，这限制了对这些特殊结构的深入研究。

为了解决这一问题，研究人员提出了一种更高效的高纯度分离方法，即通过预处理HPLC的循环技术实现对木糖二糖异构体的单步纯化。这种方法允许产物多次通过同一色谱柱，从而提高了对紧密洗脱异构体的分离效率。此外，研究人员假设由于木糖二糖异构体的结构差异，它们在促进有益肠道细菌增殖方面的效果也会有所不同。因此，本研究的目标是开发一种高效的纯化方法，用于从木糖中合成的木糖二糖异构体的分离，并对其基于连接方式的益生特性进行结构表征和评估。

在实验材料方面，研究人员使用了从Bacillus pumilus IPO中克隆并表达的β-xylosidase基因，同时获得了高纯度的木糖（>98%）以及用于诱导表达的异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）。此外，还使用了高纯度的β-1,4-木糖二糖（>95%）作为对照。实验中采用的HPLC级乙腈确保了色谱分析的准确性和可靠性。

在反应模式和木糖二糖产量的研究中，研究人员将6.68 M的木糖底物与6.5 U/mL的β-xylosidase在蒸馏水中进行反应，反应温度控制在50°C，持续24小时。蒸馏水被选作反应溶剂，是因为它在工业规模生产木糖二糖时具有更高的效率。反应产物通过HILIC-HPLC-ELSD系统进行分析，结果显示了三种不同的产物峰，这表明在反应过程中形成了多种木糖二糖异构体。这些产物的分离和纯化过程为后续的结构分析和益生特性评估奠定了基础。

在结论部分，研究人员成功通过β-xylosidase的缩合反应合成了木糖二糖异构体，并在饱和木糖溶液（6.68 M）中实现了18.5%的转化率。值得注意的是，该逆向酶促反应不仅产生了预期的β-1,4-连接的木糖二糖，还意外得到了β-1,2-和β-1,3-连接的异构体。这表明β-xylosidase在催化反应过程中具有一定的灵活性，能够生成多种连接方式的木糖二糖。研究人员开发了一种高效的预处理HPLC循环方法，成功实现了对这些木糖二糖异构体的高纯度分离，为进一步研究它们的连接特异性益生特性提供了重要支持。

本研究的成果不仅为木糖二糖的合成和纯化提供了新的方法，也为益生元研究开辟了新的方向。通过结构表征和益生特性评估，研究人员能够更深入地理解不同连接方式的木糖二糖对肠道微生物群落的影响，从而为开发具有特定益生效果的食品成分提供了科学依据。此外，该研究还强调了高效纯化技术在推动益生元研究中的重要性，特别是在探索新型益生元成分时，高纯度的分离方法能够显著提高研究的准确性和实用性。