综述：生牛奶和乳制品中嗜冷细菌的检测与鉴定方法：综述

《Food Chemistry》：Detection and identification approaches of psychrotrophic bacteria in raw milk and dairy products: A review

　　乳制品中嗜冷菌的腐败机制与快速检测技术研究

　　牛奶和乳制品因其丰富的营养成分，为微生物提供了理想的生长环境。在低温储存过程中，嗜冷菌（psychrotrophic bacteria）常常成为这些产品中的主要微生物群落。这类细菌能够产生耐热的胞外或胞内酶，如蛋白酶和脂肪酶，这些酶即使在高温处理后仍可能保持一定的活性，从而导致乳制品的变质并影响其质量和安全性。因此，开发快速、敏感且有效的检测方法，以识别乳制品中的嗜冷菌，对于维持产品质量和防止经济损失具有重要意义。传统的检测方法通常需要较长的时间，甚至长达10天，而基于分子生物学的检测技术则显著缩短了检测周期，提升了检测效率，并将灵敏度提高到约1个菌落形成单位（CFU）/毫升，从而实现了更早的产品预警。本文系统地比较了传统与新兴的检测方法，并进一步探讨了嗜冷菌检测技术的发展及其在实际中的应用。

嗜冷菌在乳制品中的存在和影响，与储存条件、季节变化、地理位置等因素密切相关。研究表明，不同种类的嗜冷菌在乳制品中表现出显著的多样性与丰度。例如，Yang等人（2020）从生乳中分离出585株嗜冷菌，其中包括假单胞菌（Pseudomonas）153株、乳球菌（Lactococcus）63株、不动杆菌（Acinetobacter）59株、黄杆菌（Chryseobacterium）53株、葡萄球菌（Staphylococcus）40株、黄单胞菌（Janthinobacterium）24株、黄杆菌（Flavobacterium）16株、棒状杆菌（Rothia）15株、肠球菌（Enterococcus）14株、梭菌（Clostridium）12株、嗜冷菌（Psychrobacter）11株、莫拉菌（Moraxella）11株、表皮葡萄球菌（Macrococcus）10株和微杆菌（Microbacterium）10株。其中，假单胞菌占据主导地位，尤其是荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）和弗拉吉假单胞菌（Pseudomonas fragi）是主要的种类。此外，嗜冷菌的多样性还受到季节、地理环境和温度的影响，这些因素使得在储存过程中维持乳制品质量变得尤为复杂。

面对嗜冷菌带来的挑战，现有的干预策略主要依赖于低温处理，如将生乳冷却至4°C，并在储存和运输过程中保持在6°C以下。然而，这种处理方式并不能完全抑制嗜冷菌的生长，尤其是在储存过程中，某些嗜冷菌仍能繁殖，从而缩短产品的保质期。相比之下，高温处理（如巴氏杀菌和超高温灭菌）虽然能够有效杀灭大多数导致乳制品变质的微生物，包括致病菌和嗜冷菌，但嗜冷菌所产生的耐热酶却可能在高温处理后仍然保持一定的活性。例如，一项研究发现，在301株测试的嗜冷菌中，有84株表现出超过70%的残留蛋白酶活性，另有48株显示出超过70%的残留脂肪酶活性。这些酶能够与乳制品中的成分发生反应，导致异味和风味的改变，甚至形成老化凝胶，从而严重损害乳制品的整体质量。此外，生乳中还可能存在细菌孢子，这些孢子在巴氏杀菌过程中能够存活，并在后续的冷却或储存过程中萌发并繁殖，进一步加剧乳制品的变质问题。因此，嗜冷菌及其孢子在乳制品生产链中的再污染，是导致乳制品过早变质的重要原因之一。

嗜冷菌对乳制品质量的影响不仅限于感官特性，还可能带来严重的经济和公共健康后果。据估计，乳制品行业因嗜冷菌引起的变质和质量下降而损失了约30%的产品（Samarzija et al., 2012）。在美国，每年因乳制品变质而浪费的液态奶达到18.1%，即17.4亿磅（Lu & Wang, 2017）。这种浪费不仅带来了直接的经济损失，还对环境和公共健康产生影响。例如，嗜冷菌中的一些致病菌，如李斯特菌（Listeria monocytogenes），对人类健康构成严重威胁，其引起的食品安全问题可能导致高达28亿美元的损失（El Sheikha, 2021）。因此，及时检测嗜冷菌的污染情况，以便采取有效的干预措施，是减少这些损失的关键所在。

为了应对嗜冷菌带来的挑战，研究人员已经开发了多种检测方法。传统方法主要依赖于平板计数法（plate-counting approach），这是基于标准平板计数（SPC）的方法，用于食品样本中细菌的计数。在进行嗜冷菌检测时，首先需要将样本稀释至合适的浓度，然后将其接种到标准化的平板计数琼脂上，并在5至7°C的条件下进行有氧培养，通常需要7至10天的时间，以便观察菌落的生长情况。尽管这种方法具有一定的准确性，但其耗时较长，难以满足现代乳制品工业对快速检测的需求。

随着分子生物学技术的发展，基于核酸扩增的方法（如聚合酶链反应，PCR）被广泛应用于嗜冷菌的检测。PCR是一种成熟且可靠的技术，能够通过核酸扩增快速检测目标基因。自20世纪末以来，PCR已被用于嗜冷菌的检测，并在乳制品行业中得到了应用。该方法通过高效扩增特定的目标基因，使嗜冷菌的检测和鉴定变得更为迅速，结果通常通过凝胶电泳进行可视化。然而，PCR方法的灵敏度和特异性依赖于引物的设计和检测条件的优化，因此在实际应用中仍需进一步改进。

除了PCR方法，免疫学技术也被广泛用于嗜冷菌的检测，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫磁分离（IMS）、免疫荧光（IF）和微板免疫捕获（IC）等方法。ELISA作为一种常见的免疫分析方法，通常在96孔板上进行，能够显著提高检测通量，因此在食品中致病菌的检测中被广泛应用（Ziyaina et al., 2020）。IMS则是一种高效的检测方法，能够通过磁性颗粒对目标微生物进行富集，从而提高检测的灵敏度和特异性。此外，免疫荧光和微板免疫捕获等技术也显示出良好的应用前景，它们能够通过荧光标记或免疫捕获的方式，实现对嗜冷菌的快速识别。

近年来，生物传感器技术在嗜冷菌检测领域取得了显著进展。生物传感器具有高灵敏度和快速响应的特点，能够检测到单个细菌的存在。例如，Zhong等人（2020）开发了一种基于先进纳米材料的荧光生物传感器，其检测限（LOD）达到了1 CFU/mL。类似地，Wang等人（2025）构建了一种荧光生物传感器，能够实现对嗜冷菌的高灵敏度检测。这些技术不仅提高了检测的准确性，还减少了检测所需的时间和成本，为乳制品行业的质量控制提供了新的解决方案。

此外，基因测序技术也被用于嗜冷菌的检测和分类。通过高通量测序（HTS）等方法，研究人员能够对乳制品中的微生物群落进行全面分析，从而更准确地识别出可能引起变质的嗜冷菌种类。这种技术的优势在于其能够提供关于微生物群落结构的详细信息，有助于理解嗜冷菌在乳制品中的生态行为及其对产品质量的影响。然而，基因测序技术的成本较高，且需要专业的设备和人员进行操作，因此在实际应用中仍需进一步优化和推广。

在检测方法的选择上，需要综合考虑其灵敏度、特异性、检测时间和成本等因素。传统方法虽然在某些情况下仍具有一定的应用价值，但其局限性使得现代乳制品行业更倾向于采用分子生物学和生物传感器等新兴技术。这些技术不仅能够提供更快速的检测结果，还能够实现对嗜冷菌的高灵敏度识别，从而为乳制品的质量控制和安全监管提供有力支持。然而，目前仍没有一种检测方法能够完全满足所有需求，因此需要进一步的研究和技术创新，以开发更加高效、经济且易于操作的检测方案。

总之，嗜冷菌在乳制品中的存在和影响是一个复杂而重要的问题。为了确保乳制品的质量和安全，必须采用快速、敏感且有效的检测方法。本文系统地比较了传统与新兴的检测方法，并探讨了嗜冷菌检测技术的发展趋势及其在实际中的应用。通过总结这些方法的技术进步和实际效果，本文旨在为乳制品行业提供可靠的检测策略，从而有效应对嗜冷菌带来的挑战。