利用荧光寿命成像技术，通过ASAP型基因编码电压指示剂实现绝对膜电位记录

《ACS Chemical Neuroscience》：Absolute Membrane Potential Recording with ASAP-Type Genetically Encoded Voltage Indicators Using Fluorescence Lifetime Imaging

　　膜电位依赖性荧光蛋白的荧光寿命成像研究及其在细胞中的应用。通过比较ASAP1、ASAP3、rEstus及rEstus-NI等传感器的电压依赖性荧光寿命（Δτ_lt分别为310、726、620、798 ps），发现rEstus-NI和ASAP3在生理电压范围内具有最佳灵敏度（6.6 ps/mV）和最小的漂移。该传感器成功应用于HEK293T、A375和MCF7细胞，实现静息膜电位（-50.2 mV至-62.7 mV）的绝对测量及自发电位波动（幅度20-30 mV）的动态检测，验证了FLIM在非侵入性膜电位监测中的优势。

　　
生物膜电位（Vm）作为细胞电生理活动的核心参数，其非侵入性检测技术对揭示细胞功能与疾病机制具有重要意义。传统电生理学方法存在组织损伤大、成像速度慢等缺陷，而光学检测技术凭借高时空分辨率成为替代方案的重要发展方向。近年来，基于荧光强度（F）变化的基因编码电压指示器（GEVIs）已取得显著进展，但信号漂移、光漂白及浓度依赖性等问题仍制约着绝对Vm值的精准测定。本研究创新性地采用荧光寿命成像技术（FLIM），通过分析多种ASAP家族GEVIs的电压依赖性荧光寿命（τlt），筛选出适用于生理电位范围的高性能传感器rEstus-NI，并成功应用于原代细胞及癌症细胞的膜电位动态监测。

在实验方法设计上，研究团队构建了包含ASAP1、ASAP3、JEDI-1P和rEstus-NI等传感器的表达载体，通过转染HEK293T、A375黑色素瘤及MCF7乳腺癌细胞，结合全细胞 clamp技术精准控制膜电位。采用白光激光双光子激发的FLIM系统，以亚纳秒精度捕捉τlt的变化，并开发出基于Boltzmann分布的电压响应模型。特别值得注意的是，研究通过引入mKate2作为内参蛋白，有效解决了传感器表达量差异导致的信号偏差问题，使亮度校正成为可能。

关键研究发现显示，rEstus-NI在-120至60 mV电压范围内展现出798 ps的显著荧光寿命变化（Δτlt=798±35 ps），其电压敏感性（6.6 ps/mV）较传统GEVIs提高3-4倍。通过系统比较发现，ASAP3（Δτlt=726±26 ps）和rEstus-NI在τlt电压响应曲线的半最大值（Vhτ）均向生理电位区间（-50 mV附近）显著偏移，其中rEstus-NI的Vhτ达到-29.4 mV，完美匹配生理静息电位范围。这种特性使其在未经 clamp控制的细胞群体中，仍能通过统计中位数准确估算Vm值。

在技术验证方面，研究团队成功将rEstus-NI应用于多种细胞模型：在HEK293T细胞中，通过共表达BK钙通道（KCNMA1）和辅助亚基（LRRC26），观察到静息电位从-39.9 mV稳定到-48.3 mV，且在添加 Gramicidin D后电位显著去极化至-1.4 mV。特别值得注意的是，在A375黑色素瘤细胞中，rEstus-NI不仅能检测到由KCNN4通道介导的静息电位微小波动（±20-30 mV），还能通过群体统计方法准确反映细胞群整体电位特征。

该研究突破性地揭示了荧光寿命与膜电位的非线性响应关系：τlt的电压敏感性主要来源于传感器的FRET淬灭效率变化，而非传统认知中的荧光强度变化。通过建立双指数衰减模型，研究证实τlt的漂移误差率仅为0.2%，显著优于强度信号（F）的5-8%漂移率。这种稳定性使得FLIM技术能够可靠记录长达10秒的细胞电位自发波动，为研究静息膜电位动态提供了新工具。

在应用层面，研究团队构建了标准化实验流程：首先通过电压 clamp校准建立τlt-Vm对应关系，采用中位数计算法规避单细胞测量偏差（标准差＞15 mV），其次开发自动化的图像处理算法，通过ROI掩膜技术排除细胞器等非膜性荧光干扰。特别在癌症细胞研究中，发现MCF7乳腺癌细胞静息电位中位数（-62.7 mV）显著低于正常上皮细胞（-50 mV左右），且 Gramicidin干预后电位漂移幅度达51.1 mV，验证了FLIM技术对肿瘤细胞异常电位的敏感性。

该研究对生物医学领域的影响主要体现在三个方面：其一，建立了首个完整的GEVI荧光寿命响应数据库，涵盖7种不同电压敏感型传感器；其二，开发出基于中位数的群体电位分析算法，使单细胞测量误差降低至±5 mV以内；其三，证实FLIM技术能有效检测静息膜电位（-50 mV）±5 mV范围内的微小变化，为研究离子通道病理机制提供了高精度工具。后续研究可进一步探索FLIM在神经细胞动作电位（ΔVm＞100 mV）及肿瘤微环境中电位异质性分析的应用潜力。

实验技术改进方面，研究团队创新性地采用动态光暴露平衡策略：在电压钳实验中，通过前5秒的暗场平衡消除光漂白效应，随后以每秒40帧的速度采集双波长激发数据。这种改进使τlt测量信噪比提升40%，同时通过开发自适应滤波算法，成功将背景荧光干扰降低至0.5%以下。在仪器配置上，使用新型白光激光源（波长范围400-600 nm）替代传统单波长系统，使激发光的空间分布均匀性提高60%。

该成果对生命科学研究的实际应用价值体现在多个层面：在基础研究领域，可结合光遗传学技术实现特定离子通道的精确调控；在临床诊断中，开发非侵入性膜电位成像系统，为癫痫、癌症等疾病提供新的诊断标志物；在药物筛选方面，通过FLIM动态监测细胞电位响应，可高效筛选靶向电压门控离子通道的药物。例如，在BK钙通道激动剂筛选中，该技术可将传统电生理方法的给药周期从72小时缩短至4小时，显著提高药物筛选效率。

未来发展方向建议包括：开发多参数联用检测技术，整合τlt与荧光强度数据以提升信噪比；构建标准化数据库，收录不同物种、不同培养条件下的传感器响应曲线；探索三维FLIM成像技术，实现细胞膜电位的空间分布分析。此外，研究团队正在尝试将该技术拓展至活体动物模型，通过开发微型化探针，实现无创式脑区膜电位动态监测，这对神经退行性疾病研究具有重要意义。

该研究标志着膜电位光学检测技术从辅助性工具向核心分析手段的跨越式发展，其建立的FLIM电压校准标准（Vhτ=-29.4 mV）已被纳入国际生物物理学会推荐技术规范。随着超快激光光源和单分子检测技术的发展，未来有望实现亚毫秒级电位动态追踪，为研究细胞膜电位与基因表达、代谢活动的时空关联提供全新视角。