δ-内毒素Cry1Ca17的结构解析及来自苏云金芽孢杆菌BUPM14菌株的生物与分子对接研究

　　发现Bacillus thuringiensis BUPM14菌株携带新Cry1C基因（Cry1Ca17），通过16S rDNA测序和分子分类确认其属于kurstaki亚种。结构模拟显示该毒素与Cry1Ca1高度相似（99%），但存在关键氨基酸差异。分子对接揭示Cry1Ca17与APN受体结合位点（Asp197、Leu251等），对Ephestia kuehniella和Agrotis ipsilon的LC50分别为113.20 μg/g和1.04 μg/cm2，且无抗性风险。

　　

### 新型Bt δ-endotoxin的发现与功能解析——以Cry1Ca17为例#### 1. 研究背景与意义

植物病虫害是威胁全球粮食安全的主要问题之一。传统化学农药因环境污染和抗药性产生，促使生物农药的研发成为重点。芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）产生的δ-endotoxin因其高效昆虫毒性和环境友好性，已成为生物农药的核心成分。目前已发现超过765种Bt δ-endotoxin，但新型毒蛋白的持续发现对应对抗药性害虫至关重要。本研究的核心目标是从突尼斯土壤中分离出新型Bt菌株BUPM14，并鉴定其编码的新型δ-endotoxin（Cry1Ca17）。#### 2. 新菌株BUPM14的鉴定

通过传统微生物学方法（革兰氏染色、运动性检测、孢子形成等）结合16S rDNA测序，确认BUPM14属于Bt属。分子生物学分析显示：

- **质粒图谱**：与已知的Bt亚种kurstaki（HD1菌株）质粒图谱高度相似，支持其分类。

- **毒素谱分析**：SDS-PAGE检测到135 kDa的Cry1类毒素蛋白，与已报道的Cry1类毒素分子量一致。

- **基因组筛查**：通过PCR检测发现BUPM14携带cry1A、cry1C和cry2A基因，其中cry1C为首次在该亚种中发现，提示其可能来源于水平基因转移。#### 3. Cry1Ca17的分子特征

- **基因序列**：成功扩增并测序3573bp的cry1C基因，GenBank登录号MN857457。该基因编码的毒素蛋白含1190个氨基酸，分子量134.67 kDa。

- **理化性质**：

- **酸性特征**：等电点5.00，负电荷残基（164）显著多于正电荷残基（116），推测其水溶性良好（GRAVY指数-0.415）。

- **稳定性**：不稳定指数36.35（<40为稳定），预测在环境中不易降解。

- **激活机制**：经胰蛋白酶切割后形成66 kDa的活性核心，其半衰期在哺乳动物细胞中达30小时，表明代谢稳定性较高。#### 4. 结构与功能解析

- **结构域特征**：Cry1Ca17包含7个结构域，其中：

- **核心结构域（DI-DIII）**：与Cry1Ac类似，形成三螺旋束构象，负责膜孔形成。

- **非核心结构域（DIV-VII）**：DIV（626-689）和DV（693-877）与Cry1Ac高度保守，但DVI和DVII序列差异显著。

- **关键残基对比**：与Cry1Ca1（参考株）相比，Cry1Ca17存在9个氨基酸差异：

- **活性相关残基**：Leu63、Arg488、Gly625等位于核心结构域，可能影响毒素-受体结合。

- **非活性差异位点**：如Ala125、His454等位于次要结构域，可能与晶体稳定性相关。#### 5. 毒理活性验证

- **体外毒力测试**：

- 对**Ephestia kuehniella**（蛾类幼虫）的LC50为113.2 μg/g，与HD1（kurstaki亚种参考株）相当，显著优于HD133（aizawai亚种）。

- 对**Agrotis ipsilon**（切叶蚁幼虫）的LC50为1.04 μg/cm2，表明对鳞翅目害虫具有广谱毒性。

- **协同效应**：Cry1A与Cry1C的协同毒性可增强对鳞翅目害虫的控制效果，降低单一毒素使用频率。#### 6. 分子互作机制

- **受体结合分析**：

- **受体类型**：Cry1C类毒素主要靶向APN（氨基肽酶N）受体，该受体在鳞翅目幼虫肠道刷状膜表面表达。

- **结合位点**：

- **毒性结合域（Loop3）**：包含Arg410、Thr413、Pro414，其突变会显著降低毒性（实验数据支持）。

- **特异性结合域（Loop2）**：Val101、His132等残基形成氢键网络，与NGA糖苷配体结合。

- **分子对接结果**：

- **活性核心-受体结合**：Cry1Ca17与APN受体形成40个相互作用（27氢键、4静电作用、9疏水作用），与Cry1Ca1相比新增Pro350/Ile305和Pro350/Arg260相互作用。

- **糖苷识别**：NGA配体通过4个氢键（Arg491、Ser552）和1个疏水作用（Val521）与Cry1Ca17的Cys-Loop结构域结合，与Cry1Ac（PDB:4w8j）的相互作用模式相似但关键残基不同。#### 7. 耐药性防控潜力

- **多基因协同**：BUPM14携带cry1A、cry1C和cry2A基因，形成多靶点防御体系。Cry1A与Cry1C的协同作用可延缓抗药性发展。

- **环境适应性**：高稳定性（半衰期>10小时）和低热变性（Tm>90℃）特性使其在田间施用条件（高温、高湿）下保持活性。

- **生态安全性**：对蜜蜂（Apis mellifera）、蚯蚓（Folsomia candida）和水蚤（Daphnia magna）无毒性，符合绿色农药标准。#### 8. 研究创新点

- **新亚型发现**：首次在kurstaki亚种中发现Cry1C基因，挑战传统分类中该基因仅存在于aizawai亚种的认知。

- **结构域功能扩展**：Cry1Ca17的DIV和DVII结构域可能参与晶体组装调控，其突变体在晶体形成效率上下降30%-40%。

- **多靶点机制**：通过同时激活APN和ALP（碱性磷酸酶）受体，可能增强对双翅目和鳞翅目害虫的防控效果。#### 9. 应用前景与挑战

- **制剂开发**：建议采用晶体包被技术提升环境稳定性，并开发纳米封装制剂以延长作用时间。

- **抗性管理**：需监测鳞翅目害虫对Cry1C的耐药性，目前已有对Cry1Ac抗性显著的Bacmidia思潮sin（Spodoptera exigua）品系被报道。

- **登记流程**：建议按照ISO 10993标准进行毒理学评估，重点关注对水生生物的非靶标效应。#### 10. 未来研究方向

- **全结构解析**：建议采用冷冻电镜技术解析完整毒素蛋白的三维结构，特别是DVI和DVII结构域。

- **多组学生物信息**：结合转录组（分析毒素表达调控）和代谢组学（评估田间代谢产物），优化制剂配方。

- **生态风险评估**：需评估Cry1Ca17对土壤微生物群落（如放线菌门）的长期影响。#### 11. 结论

本研究成功分离并鉴定了BUPM14菌株，其携带的Cry1Ca17毒素在毒理活性和作用机制上均具有显著创新性。该毒素通过优化APN受体结合位点的氢键网络（新增3处相互作用）增强了对鳞翅目害虫的活性，且对已知Cry1A抗性菌株（如B. thuringiensis HD133衍生株）仍保持有效。建议后续研究聚焦于：

1. 建立Cry1Ca17的晶体结构数据库

2. 开发基于毒素-糖苷复合物的新型微胶囊制剂

3. 监测全球范围内Cry1C基因的基因流动态该成果为Bt毒素的持续创新提供了新方向，尤其在应对蛲虫（Cuterebra幼虫）和甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）等抗药性严重的害虫方面具有重要应用价值。