利用CRISPR/Cas9系统对人类纤维肉瘤细胞中的I型胶原α基因进行突变

《Biochemistry》：Mutation of the Collagen Type 1α Gene in Human Fibrosarcoma Cells Using the CRISPR/Cas9 System

　　衰老相关胶原蛋白信号通路与细胞周期调控研究，通过CRISPR/Cas9编辑COL1A1基因验证突变，发现编辑后细胞胶原蛋白减少、SA-β-gal活性升高，并伴随CDC2/CDk2/cyclin D表达上调及MMP-1/-2/-9、AKT/p-mTOR表达下降，揭示胶原蛋白代谢与衰老表型的关联性。

　　

结缔组织中的胶原蛋白在衰老表型的表现中起着关键作用。虽然胶原蛋白的生成会随着年龄的增长而减少，但胶原酶的表达会增加，从而导致胶原蛋白的分解。本研究的目的是探讨通过CRISPR/Cas9系统编辑COL1A1基因后，与胶原蛋白信号通路、细胞周期及衰老表型相关的蛋白质和基因表达的变化。COL1A1基因的突变是通过CRISPR/Cas9系统诱导产生的。使用Sanger DNA测序和Indel分析方法来验证突变的诱导效果。通过胶原蛋白染色试验、SA-β-半乳糖苷酶染色试验、RT-PCR试验、Western blot分析、明胶酶谱分析以及免疫荧光染色试验来评估突变细胞的衰老表型。Sanger DNA测序分析表明，本研究成功建立了具有COL1A1基因突变的人类纤维肉瘤细胞模型。瑞士蛋白质建模分析显示，编辑后的细胞中COL1A1的结构发生了改变。此外，尽管胶原蛋白的生成量减少，但编辑后的细胞中SA-β-半乳糖苷酶的染色强度却有所增加。研究还发现，通过上调MDM2的表达，下调p53和p21的水平，编辑后细胞中CDC2、CDk2和cyclin D的表达水平上升；同时，MMP-1、MMP-2、MMP-9、AKT和p-mTOR的表达水平降低。这些发现有助于揭示胶原蛋白生成与细胞衰老之间的密切关系。