转基因CP4-EPSPS芥菜杂交种对陆生分解者寻常卷甲虫肠道及粪便微生物群落的影响

《Microbial Ecology》：Effects of CP4-EPSPS-Containing Brassica juncea Hybrids on the Gut and Fecal Microbiota of the Terrestrial Decomposer Armadillidium vulgare

　　本研究针对转基因CP4-EPSPS芥菜杂交种在自然生态系统中的扩散问题，通过喂食实验探究其对关键分解者寻常卷甲虫(Armadillidium vulgare)肠道及粪便微生物群落的影响。研究发现虽然宿主生存率无显著变化，但微生物群落结构、功能谱及互作网络发生显著改变，特别是真菌群落中Plectosphaerella(Glomerellales)比例上升。该研究为评估转基因植物材料对生态系统功能的潜在影响提供了新视角。

　　

随着转基因作物在全球农业中的广泛种植，其基因向野生近缘种的非故意扩散已成为生态安全领域的重要关切。在韩国自然生态系统中，研究人员发现了含有CP4-5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(CP4-EPSPS)基因的芥菜(Brassica juncea)杂交种，这些杂交种被认为是通过基因流从转基因甘蓝型油菜(Brassica napus)与芥菜杂交而形成的。CP4-EPSPS基因源自土壤农杆菌(Agrobacterium sp.)CP4菌株，赋予作物对广谱除草剂草甘膦的抗性。然而，这些含有外源微生物基因的植物材料进入自然生态系统后，可能通过改变植物-分解者-微生物的互作关系，进而影响有机质分解和养分循环等关键生态过程。

为探究这一问题，研究人员以陆生生态系统中的优势分解者——寻常卷甲虫(Armadillidium vulgare)为模型生物，开展了为期7天的喂食实验。研究团队从韩国群山市的路边生境采集了转基因杂交种(GM-hybrid)和野生型(WT)芥菜的凋落叶，并通过CP4-EPSPS试纸条和特异性PCR验证了转基因杂交种中目标基因的存在。实验设置对照组(喂食WT凋落叶)和处理组(喂食GM-hybrid凋落叶)，在受控条件下观察卷甲虫的生存率、体重变化及凋落叶消耗量，并重点分析了其肠道和粪便中细菌与真菌群落的组成、结构、功能预测及互作网络。

研究发现，尽管两组卷甲虫的生存率、体重增长及凋落叶消耗量均无显著差异，但其肠道和粪便微生物群落却表现出显著变化。主坐标分析(PCOA)结合相似性分析(ANOSIM)和置换多元方差分析(PERMANOVA)显示，处理组肠道真菌群落结构与对照组差异极显著(p<0.001)，细菌群落亦有显著差异(p<0.05)。在分类学水平上，处理组肠道和粪便中真菌门Glomerellales（尤其是属Plectosphaerella）的相对丰度显著升高。α多样性分析表明，处理组肠道细菌的香农指数(Shannon index)降低，而真菌的香农指数升高。线性判别分析(LEfSe)进一步识别出多个生物标志物ASV，如处理组肠道中的BASV1(Vibrio sp.)和多个Plectosphaerella ASV。

微生物共现网络分析揭示了组间特异的互作模式。网络模块化分析识别出转基因杂交种特异性模块和野生型特异性模块。转基因杂交种特异性模块中包含了约三分之一在处理组肠道中鉴定的生物标志物ASV。功能预测分析(FAPROTAX用于细菌，FUNGuild用于真菌)表明，处理组肠道细菌的发酵功能相关基因丰度降低，而真菌的植物腐生营养功能显著增强。这些微生物群落结构和功能的变化，暗示了转基因植物材料可能通过间接途径影响分解者相关的微生物群落，进而潜在地影响生态系统的分解效率和养分循环。

本研究主要采用了以下关键技术方法：利用CP4-EPSPS免疫层析试纸条和GT73品系特异性PCR进行转基因杂交种鉴定；在受控环境下进行为期7天的卷甲虫喂食实验；通过Illumina MiSeq平台对细菌16S rRNA基因V3-V4区和真菌ITS1区进行扩增子测序；使用DADA2流程进行扩增子序列变异(ASV)分析；基于Silva和UNITE数据库进行物种注释；利用LEfSe进行生物标志物识别；通过Spearman相关性构建微生物共现网络并分析拓扑性质；应用FAPROTAX和FUNGuild进行微生物功能预测。

微生物群落组成与结构变化

通过比较喂食不同凋落叶的卷甲虫肠道及粪便微生物群落，研究发现转基因杂交种凋落叶的摄入显著改变了微生物群落结构。主坐标分析显示，肠道细菌和真菌群落在GM-hybrid-fed组和WT-fed组间呈现明显分离。在门水平上，处理组肠道真菌群落中Glomerellales的比例约为对照组的两倍，其中Plectosphaerella属占据主导地位。细菌群落中，黄杆菌目(Flavobacteriales)在处理组粪便中的相对丰度显著高于对照组。

微生物多样性差异

Alpha多样性分析揭示了组间微生物多样性的差异模式。尽管凋落叶样本本身具有最高的多样性指数，但处理组卷甲虫肠道细菌的香农多样性指数显著低于对照组，而肠道真菌的香农指数则显著升高。这种细菌与真菌多样性对转基因凋落叶摄入的相反响应趋势，暗示了不同微生物类群对植物材料中特定化合物的敏感性可能存在差异。

微生物互作网络重构

微生物共现网络分析揭示了转基因杂交种摄入导致的微生物互作模式重构。肠道微生物网络包含570个节点和5060条边，粪便网络包含499个节点和2770条边。两个网络均表现出小世界特性(小世界系数>1)。模块化分析识别出转基因杂交种特异性模块、野生型特异性模块和中性模块。值得注意的是，大多数网络连接器位于中性模块中，表明转基因杂交种特异性模块对整体网络结构的影响可能有限。

微生物功能谱改变

功能预测分析表明，转基因杂交种凋落叶的摄入改变了微生物群落的功能潜力。在处理组卷甲虫肠道中，细菌的发酵功能相关基因预测丰度降低，而真菌的植物腐生营养功能显著增强。这些功能变化可能与有机质分解效率和宿主营养代谢相关，尽管其直接的生态效应仍需通过实验进一步验证。

本研究首次揭示了摄入含有CP4-EPSPS的芥菜杂交种凋落叶对关键分解者寻常卷甲虫肠道及粪便微生物群落的显著影响。尽管在短期内未观察到对宿主生存和生长的直接毒性效应，但微生物群落组成、互作网络和功能谱的改变，特别是真菌群落中Plectosphaerella的富集和细菌/真菌多样性的相反变化趋势，表明转基因植物材料可能通过间接途径影响分解者相关的微生物生态系统。这些微生物水平的变化可能作为评估转基因植物材料生态风险的早期敏感指标。研究建立的实验框架可扩展应用于其他作物衍生杂交种或不同的生态情境，为未来评估转基因对生态系统功能的影响提供了重要基础。然而，由于研究中使用的杂交种本身可能携带除CP4-EPSPS转基因外的其他遗传变异，且实验周期相对较短，长期生态效应仍需进一步研究。