DNA宏条形码技术在医院环境真菌评估中的贡献与应用前景

《Microbial Ecology》：Contribution of DNA Metabarcoding to the Environmental Fungal Assessments in Hospitals

　　本研究针对医院环境中免疫抑制患者易感侵袭性真菌感染(IFI)的严峻问题，采用DNA宏条形码(DNA metabarcoding)和定量PCR(qPCR)技术，对三家西班牙医院的空气、表面和灰尘样本进行大规模真菌群落分析。研究发现DNA宏条形码比传统培养法多检测出90%以上的真菌物种，揭示了以子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)为主导的医院真菌群落结构，并识别出包括假丝酵母(Candida)和曲霉(Aspergillus)在内的多种机会性病原体。该研究为医院环境微生物监测提供了更全面的技术方案，对预防医院获得性真菌感染具有重要意义。

　　

在医院这个特殊环境中，免疫抑制患者面临着侵袭性真菌感染(IFI)的严重威胁。近年来，随着免疫缺陷患者数量的增加和抗真菌药物耐药性的出现，IFI的发病率持续攀升。特别是在COVID-19大流行期间，曲霉病、毛霉病和念珠菌血症等IFI病例显著增加，使得医院环境的真菌监测变得尤为重要。

目前，医院环境的微生物监测主要依赖传统的培养方法，这种方法虽然能检测存活菌株，但存在明显局限性——超过90%的真菌无法通过标准培养基培养。这使得我们对于医院环境中真菌多样性的认识存在巨大空白。为了解决这一问题，Laura García-Gutiérrez、Emilia Mellado和Pedro M. Martin-Sanchez等研究人员在《Microbial Ecology》上发表了一项开创性研究，首次将环境DNA(eDNA)技术大规模应用于医院真菌群落分析。

研究人员在冬季和秋季两个季节，对西班牙三家三级医院的不同区域进行了系统采样，包括室外区域、入院大厅、普通病房和重症监护室(ICU)。他们收集了200多份空气、表面、灰尘和土壤样本，并同时采用DNA宏条形码和qPCR技术进行分析，与传统的培养方法进行对比。

研究团队运用了几项关键技术：通过离心采样器(Coriolis μ)收集空气样本并进行DNA提取；采用ITS区域特异性引物进行两轮PCR扩增建立真菌文库；使用Illumina MiSeq平台进行高通量测序；利用DADA2和LULU算法进行生物信息学分析；同时建立真菌通用qPCR方法进行定量检测。

DNA宏条形码数据特征和α多样性

DNA宏条形码技术显著提高了真菌物种的检测能力，每个样本检测到的操作分类单元(OTU)数量为2-273个(中位数32个)，而传统培养法仅能检测0-16个菌落形成单位(CFU)。空气样本的真菌丰富度最高，其次是土壤和表面样本。重症监护室(ICU)的真菌多样性显著低于其他区域，这与其严格的访问控制和HEPA过滤通风系统有关。

真菌群落组成

研究共鉴定出1900个OTU，归属于4个门、35个纲、114个目、305个科、643个属和535个物种。医院真菌群落主要由子囊菌门(53%的OTU)和担子菌门(41.3%)主导。三种医院共有的OTU仅占9.25%，表明地理位置对真菌群落有重要影响。

驱动因素分析

PERMANOVA分析显示，医院地点(R²=10.5-16.9%)、样本类型(R²=6.5-12.1%)、医院区域(R²=4.3-7.6%)和采样季节(R²=2.4-8.6%)是解释真菌群落变异的最重要因素。颗粒物计数和相对湿度(RH)等环境变量也显示出显著但较小的解释力。

真菌负荷的qPCR分析及相关性

qPCR检测的真菌DNA浓度与培养法测得的CFU以及颗粒物计数呈显著正相关(Spearman相关系数0.66-0.77)。三种方法都显示从暴露区域(IA)到保护区域(IC)的真菌负荷递减趋势，以及秋季室外真菌负荷高于冬季的模式。

分类组成

枝孢菌(Cladosporium)是医院环境中最优势的属，在所有医院、区域和样本类型中广泛分布。其他重要属包括链格孢(Alternaria)、短梗霉(Aureobasidium)、青霉(Penicillium)和曲霉(Aspergillus)。DNA宏条形码还发现了传统培养法忽略的重要真菌类群，如假瓶霉(Pseudopithomyces)、双足囊菌(Dipodascus)和Vishniacozyma。

研究检测到多种机会性病原体，包括WHO列为高优先级的假丝酵母(Candida parapsilosis)和毛霉目(Mucorales)真菌。值得注意的是，尽管LF医院正在经历耳念珠菌(Candida auris)的暴发，但本研究未检测到该菌株，这可能与采样选择的是未报告该菌的清洁房间有关。

eDNA方法在医院微生物评估中的优缺点

DNA宏条形码技术相比传统培养法具有明显优势，能检测到更多真菌物种，且不依赖培养条件和分类学专业知识。然而，该方法也存在局限性，包括无法区分DNA来自活菌还是死菌、环境样本中生物量低易导致污染、需要复杂的对照设置等，这些因素限制了其在常规医院监测中的应用。

本研究通过综合应用DNA宏条形码、qPCR和传统培养法，全面揭示了医院环境的真菌群落特征。研究发现医院真菌群落具有高度的多样性，且受地理位置、医院区域和季节因素的显著影响。DNA宏条形码技术能检测到传统方法无法发现的真菌物种，包括一些具有临床意义的机会性病原体。

研究结果强调，DNA宏条形码可以作为医院环境监测的有力工具，特别是在建立基线微生物组数据库、识别群落失衡和评估感染风险方面。qPCR技术则提供了快速、定量的真菌负荷评估方法，与颗粒物计数有良好相关性，可作为传统培养法的有效补充。

这项研究为改进医院环境微生物评估提供了重要见解，对于保障医疗环境空气质量、预防医院获得性感染具有重要实践意义。未来研究可进一步探索这些分子方法在医院感染控制中的实际应用价值，特别是在暴发调查和风险评估中的潜力。