低温两阶段益生菌发酵策略提升猪液态饲料营养价值与安全性的机理研究

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Low-temperature two-stage probiotic fermentation enhances nutrition and safety of pig liquid feed

　　本刊推荐：为解决全价饲料中抗营养因子(ANFs)降低动物消化吸收效率、影响生长性能的问题，研究人员开展了低温和两阶段益生菌发酵提升猪液态饲料品质的研究。结果表明，采用Bacillus subtilis 3-16和Lactobacillus plantarum E5进行好氧-厌氧两阶段发酵可显著降解抗原蛋白和粗纤维(CF)，提高粗蛋白(CP)、酸溶蛋白(ASP)含量，抑制生物胺(BAs)积累，增强饲料抗氧化能力和酶活性，并促进有益菌群（如Lactobacillus、Bacillus）优势，减少病原菌（如Escherichia coli、Staphylococcus aureus）丰度。该研究为功能性发酵饲料的开发提供了理论依据和技术支持。

　　

在规模化养猪生产中，饲料成本占总成本的60%以上，而饲料中的抗营养因子(ANFs)如大豆抗原蛋白、胰蛋白酶抑制剂等，会显著降低动物的消化吸收效率，导致生长性能下降、腹泻甚至死亡，造成巨大经济损失。传统的固态发酵(SSF)存在发酵周期长、菌体密度低等问题，而液态发酵(LSF)虽具有发酵时间短、菌体密度高（可达10⁹ CFU/mL）等优势，但单一发酵模式易受杂菌污染，且难以兼顾好氧和厌氧菌的协同作用，导致发酵效果不稳定。此前Canibe和Jensen的研究甚至发现，饲喂液态发酵饲料的育肥猪生长性能显著差于对照组。这些问题的核心在于缺乏系统的功能菌株筛选体系和多菌株协同代谢机制研究。

针对这一瓶颈，新希望六和股份有限公司张傲然等研究人员在《Applied Microbiology and Biotechnology》上发表了题为"Low-temperature two-stage probiotic fermentation enhances nutrition and safety of pig liquid feed"的研究论文，开发了一种低温两阶段益生菌发酵新策略。该研究首先从土壤中分离出71株芽孢杆菌和41株乳酸杆菌，通过低温耐受性、酶活性、抑菌能力等指标筛选出功能菌株，并评估其在不同饲料原料（豆粕、麦麸、小麦等）中的发酵效果。最终优选出生猪液态饲料两阶段发酵的最佳组合：好氧阶段采用蛋白酶活性最高的Bacillus subtilis 3-16，厌氧阶段采用产酸能力强且抑菌效果显著的Lactobacillus plantarum E5。

关键技术方法包括：（1）功能菌株的多指标筛选（低温生长、酶活性、抑菌性、赖氨酸利用、防腐剂耐受性）；（2）饲料成分化学分析（CP、CF、ASP、ADF、NDF等）；（3）两阶段发酵工艺（好氧25°C 12h，厌氧25°C 12h）；（4）生物胺（TVBN、PUT、SPE）和抗氧化指标（MDA、T-AOC）检测；（5）高通量16S rRNA测序分析微生物群落动态。

筛选发酵功能菌

研究团队从112株菌中筛选出39株芽孢杆菌和22株乳酸杆菌能在20°C生长，其中23株芽孢杆菌和4株乳酸杆菌（均为Lactobacillus plantarum）具有4种以上酶活性。通过抑菌实验发现，Bacillus subtilis 3-16对Staphylococcus aureus和Erysipelothrix rhusiopathiae均有强抑制作用，而Lactobacillus plantarum E5抑菌效果最佳。酶活性检测显示，3-16的蛋白酶活性达59.74 U，显著高于文献报道的B. velezensis Z-1（16.92 U）。此外，所有菌株对赖氨酸利用率低（残留>95%），且对苯甲酸等防腐剂耐受性强，适合工业化生产。

菌株发酵能力评估

在豆粕发酵中，芽孢杆菌显著提高了CP含量（如3-16组CP从51.35%升至56.75%），并将72、68、34 kDa抗原蛋白降解为<25 kDa小肽段，其中P2、MB360和3-16效果最显著。乳酸杆菌在883全价饲料发酵中主要产乳酸和乙酸，不产生乙醇或甲酸。

两阶段发酵组合筛选

通过拮抗实验排除有抑制作用的菌株（如Bacillus licheniformis 3-24），最终12个组合中，3-16&E5发酵后pH最低（4.72）、干物质损失率最低（5.11%），且能有效降解72、52、34、19 kDa抗原蛋白，故被选为最优组合。

两阶段发酵改善饲料营养成分

与自然发酵（N组）相比，两阶段发酵（TN组和TS组）显著提高了CP、ASP和总氨氮（TAN），降低了CF。发酵24小时后，TN组和TS组的抗原蛋白几乎完全降解为小肽。pH在好氧阶段轻微上升，接种乳酸杆菌后迅速下降至4.3（N组为4.5）。

生物胺与抗氧化活性变化

两阶段发酵显著抑制了生物胺积累：24小时后，N组的总挥发性盐基氮（TVBN）和腐胺（PUT）含量显著高于TS组。丙二醛（MDA）水平在N组中较高，而两阶段发酵组保持了较低的脂质过氧化程度。蛋白酶和淀粉酶活性分别提高了64.29%和28.3%。

微生物群落动态分析

高通量测序显示，两阶段发酵显著提高了Lactobacillus和Bacillus的相对丰度，降低了Escherichia coli和Staphylococcus aureus等病原菌。主坐标分析（PCoA）表明TN组和TS组的微生物群落结构与N组差异显著。Sankey图进一步显示，TN组中Bacillaceae和Lactobacillaceae为优势菌科，而N组中Moraxellaceae和Acinetobacter丰度较高。

Spearman相关性分析

乳酸杆菌（Laciplantibacillus）丰度与ASP、酶活性呈正相关，与TVBN、PUT呈负相关；Bacillus丰度与TAN、淀粉酶活性正相关，与MDA负相关。相反，Acinetobacter与生物胺水平正相关，与营养指标负相关。

本研究证实，低温两阶段发酵通过Bacillus subtilis 3-16和Lactobacillus plantarum E5的协同作用，有效降解了饲料中的抗营养因子，提升营养价值的同时抑制了有害代谢物积累，优化了微生物群落结构。该策略为解决液态发酵饲料的稳定性问题提供了新思路，有望在养猪业中推广应用于提升动物健康和生产性能。