由Batrachochytrium dendrobatidis引起的亚临床感染在南亚溪流无尾两栖动物中的持续存在

　　两栖动物壶菌病（Bd）在印度西方高地的溪流种群中广泛传播，感染率达74.6%，但未观察到临床症状。通过捕捉-标记-重捕和定量PCR分析发现，跳跳蛙的感染状态不影响捕获概率，但存在从高感染向低感染的随机过渡，年际生存率显著低于年内。研究揭示了亚临床感染与种群动态的关系，为亚洲热带地区两栖动物疾病管理提供依据。

　　
### 摘要
隐孢子虫病（chytridiomycosis）是由壶菌属真菌Batrachochytrium dendrobatidis（Bd）引起的全球两栖动物种群下降的主要因素之一。该病原体已感染五大洲超过500种两栖动物，并在亚洲的西高止山脉（Western Ghats）等生物多样性热点区域形成持久性流行。本研究旨在揭示西高止山脉Tillari保护区溪流两栖动物中Bd的感染率、负荷及其季节性变化规律。通过连续三年的捕捉-标记-重捕（CMR）实验，结合定量聚合酶链式反应（qPCR）检测Bd的ITS1拷贝数，将感染状态分为无感染（N）、低感染（L）和高感染（H）三类。研究覆盖五个季节性溪流，在干湿恢复期（ER和LR）进行采样，并分析感染状态与宿主生存率、体况（scaled mass, SM）及环境因子（相对湿度、降雨量）的关系。

### 引言
隐孢子虫病自2000年以来导致全球超过160种两栖动物灭绝（Lips, 2016）。Bd作为环境适应型病原体，其传播机制与宿主生理特性、环境波动密切相关（McCallum, 2005）。亚洲是Bd的起源地，但关于其与本土两栖动物共存的机制仍存在知识空白。西高止山脉作为亚洲两栖动物多样性最丰富的区域之一，其溪流生态系统为研究Bd的长期影响提供了独特场景。该区域两栖动物虽未报告临床死亡病例，但缺乏系统监测数据（Sreedharan & Vasudevan, 2021）。本研究通过CMR模型分析，结合环境参数，旨在揭示以下问题：（1）Bd感染率在溪流两栖动物中的空间分布特征；（2）感染负荷与宿主生存率的关联性；（3）感染状态的季节性动态变化。

### 方法
研究区域为西高止山脉Tillari保护区的五个季节性溪流，涵盖热带湿润-落叶林及次生植被。每年雨季（5-9月）后，在干湿恢复期（ER：10月中下旬；LR：12月中下旬）进行两次采样。每条溪流设置100m×25m样带，采用标准化捕捉流程：佩戴无菌手套捕捉个体，测量体重（弹簧秤）和体长（游标卡尺），植入背部皮下PIT芯片（Global-Ident），记录捕获位置后立即释放。所有实验经伦理委员会批准（IAEC19/2018）。DNA提取采用Goka等人（2009）的改进方法，qPCR检测Bd ITS1拷贝数，阈值设定为33个循环（Ct值），低于阈值判定为阴性（N），中位数以上为高感染（H），以下为低感染（L）。

CMR模型构建采用Program MARK的多元状态闭模型，纳入感染状态（N/L/H）、体况（SM）、相对湿度（Rh）等参数。生存率分析区分年内（ER-LR）与跨年（LR-ER）周期，捕捉概率与重捕概率分别建模。假设感染状态间转换随机（非马尔可夫），并通过AICc准则选择最优模型。

### 结果
1. **感染率与负荷**
研究区域12种两栖动物中，Bd总感染率为74.6%（95% CI:74%-81%）。平均ITS1拷贝数为7079，换算为 zoospores范围为49-700。其中，印度树蛙（Euphlyctis cyanophlyctis）和Amboli跳蛙（Indirana chiravasi）感染率最高（78%和74%），且所有感染个体均无临床症状。

2. **季节动态与负荷变化**
感染率在干湿恢复期（ER/LR）间无显著差异（p=0.25），但LR期感染负荷显著降低（回归系数-0.31，p<0.01）。跨年感染率波动较大（2018:68%、2019:70.3%、2020:91.4%），可能与年降雨量变化相关（2020年降雨量达十年峰值）。

3. **宿主行为与生存率**
标记个体重捕率显著高于初次捕捉率（p<0.01），可能与标记后宿主行为适应性改变有关。体况（SM）与捕捉概率呈正相关（β=0.015，p=0.09），但感染状态对捕捉概率无显著影响。年内生存率（ER→LR）为37%（95% CI:28%-47%），显著高于跨年生存率（2%，95% CI:1%-5%），表明宿主在雨季活动后向旱季迁徙，导致年内种群稳定性较高。

4. **感染状态转换特征**
印度树蛙的感染状态转换呈现随机性（χ2=0.13，p=0.72），但存在显著状态偏好：从H/L/N状态转为低感染（L）的概率最高（N→L:48%、L→L:48%、H→L:58%），转为高感染（H）或无感染（N）的概率较低（N→H:31%、L→H:37%、H→H:29%）。

### 讨论
1. **亚临床感染的生态适应机制**
研究区域的高感染率与低死亡率提示，两栖动物可能通过免疫抑制或宿主-病原体协同进化实现亚临床感染。体况（SM）与捕捉概率的正相关表明，健康个体更易被监测到，但未发现感染负荷与生存率的直接关联（p=0.42），可能因样本量不足（仅563只树蛙数据）。

2. **环境对Bd传播的调节作用**
旱季（LR）的感染负荷下降（回归系数-0.31，p<0.01）与溪流干涸导致的宿主迁徙相关。相对湿度（Rh）未显著影响感染率（p=0.21），但高温可能抑制Bd的胞外生长（Haver et al., 2022）。需进一步研究温度与Rh的交互作用。

3. **跨物种传播与宿主多样性**
感染的树蛙、Amboli跳蛙及树蛙（Indosylvirana caeseri）均携带高剂量Bd（>10,000 zoospores），但未发现病原体在物种间传播的直接证据。可能存在隐匿宿主（如陆生两栖动物或无尾目）或水生生物（如蜻蜓幼虫）作为中间宿主（Brannelly et al., 2018）。

4. **长期监测的必要性**
研究区域两栖动物种群在2004-2022年间全球保护指数（IUCN）评分略有提升（Luedtke et al., 2023），但Bd的持续存在可能通过降低繁殖成功率（Sheriff et al., 2009）或增加幼体死亡率（K?rvemo et al., 2020）间接威胁种群恢复。建议长期追踪感染负荷变化与幼体存活率的关系。

### 结论
本研究证实西高止山脉溪流两栖动物群体中存在高Bd感染率与低临床死亡率的共存现象。感染状态转换随机性表明宿主可能缺乏特异性免疫记忆，而环境波动（如降雨量、溪流干涸）可能通过改变宿主行为（如迁徙）间接调节Bd传播。未来研究需结合多组学技术解析宿主免疫应答机制，并扩展至其他两栖物种（如夜蛙属Nyctibatrachus）及水生中间宿主，以完善Bd在亚洲热带溪流生态系统的传播模型。