利用Box–Behnken设计对石榴提取物中钙强化纳米植酸体的优化研究

《Food Science & Nutrition》：Optimizations of Calcium-Reinforced Nanophytosome of Pomegranate Extract Using Box–Behnken Design

　　ABSTRACT 研究采用薄层水合法开发新型纳米载体——纳米磷脂体（nanophytosomes），以伊朗拉弗尔石榴果提取物为活性成分，通过响应面法优化磷脂与提取物的比例（1:3）、CaCl?浓度（2.70 mM）及溶剂比例（0.82 w/w），获得粒径127.67 nm、zeta电位-39.7 mV、包封效率100%的稳定纳米制剂，显著提升活性成分的生物利用度与稳定性。

　　
该研究聚焦于利用薄层水合法优化石榴多酚纳米载体（即纳米磷脂体）的制备工艺，以提升活性成分的生物利用度。研究以伊朗拉弗尔地区红籽石榴为原料，提取包含果肉和果皮的全果多酚提取物（PFE），并通过响应面法（RSM）结合Box-Behnken设计，系统评估了磷脂配比、钙离子浓度和溶剂比例三个关键参数对纳米载体性能的影响。

**原料特性与制备工艺**
研究选用伊朗Kerman地区特有的红籽石榴，其果肉与果皮均含有高浓度多酚类物质。实验采用机械压榨法提取石榴汁液，通过低温冻干技术保存活性成分，确保总酚含量达371-370 mg/g干重（以没食子酸当量计），并检测到显著的花青素（约300.68 mg/g）和黄酮类物质（194.97 mg/100g）。抗氧化活性测试显示其清除DPPH自由基能力达91%，验证了材料的高效抗氧化特性。传统磷脂体依赖有机溶剂（如氯仿），而本研究改用乙醇作为溶剂，兼顾安全性与氢键形成能力，避免溶剂残留对最终产品的影响。

**纳米载体优化体系**
研究构建了包含三个独立变量（A: 石榴多酚与磷脂比例、B: 钙离子浓度、C: 纳米载体与溶剂比例）的三因素响应面模型。通过9组实验和软件模拟，发现以下关键规律：
1. **磷脂配比（A）**：当PFE与磷脂（PC）比例提升至1:3时，纳米颗粒粒径降至127.67 nm（P<0.01），同时ζ电位达-39.7 mV，表明负电荷密度较高，有助于颗粒间的静电排斥，从而维持分散稳定性。
2. **钙离子浓度（B）**：2.70 mM的CaCl?浓度显著降低粒径分布指数（PDI=0.357），且通过离子键强化磷脂层结构，使包封效率（EE）达100%。实验证实，钙离子浓度超过2.5 mM时，颗粒易聚集，但优化后体系在消化环境中仍能保持稳定。
3. **溶剂比例（C）**：乙醇与纳米载体的质量比控制在0.82时，最佳综合性能（目标值0.860）达成。过高的溶剂比例（>1）会导致磷脂结构松散，而比例过低（<0.4）则影响活性成分溶解度。

**性能表征与对比分析**
优化后的纳米载体在物理特性上表现出优异的均一性：粒径分布指数（PDI）仅0.357，表明99.6%的颗粒粒径集中在127.67 nm附近，符合口服给药系统对纳米颗粒尺寸的严格要求（通常<200 nm）。ζ电位-39.7 mV与文献报道的稳定磷脂体（-25~40 mV）相符，且与Mobility值-3.145 μm·cm?1形成负相关，进一步验证静电稳定机制。包封效率达100%的结果与前期研究（PC:甘油比例1:2时EE>90%）一致，但本研究通过钙离子辅助成膜，首次实现全果多酚的完全包载。

**创新性与应用价值**
该研究突破传统磷脂体仅依赖有机溶剂的局限，采用乙醇体系实现绿色制备。此外，首次系统研究钙离子浓度对纳米载体稳定性的影响，发现2.7 mM CaCl?可显著增强磷脂层交联，使冻干后颗粒分散性保持72小时以上。比较其他文献中蓝莓（0.14-0.49 mg/g）和苹果（5-10 mg/g）的较低酚含量，证实红籽石榴全果提取物的独特优势。这种高活性载体在功能性食品（如抗衰老饮品）和医药（如肠道靶向给药）中具有潜在应用，尤其适合需要长期稳定储存的磷脂体产品。

**技术验证与工业化考量**
通过DPPH自由基清除实验验证载体活性，优化后的纳米体系在0.1%浓度下即可达到78.23%的抑制率（显著高于市售蓝莓制品的45-60%）。冻干工艺的引入（-25°C冷冻干燥72小时）成功解决了磷脂体易氧化的问题，实验显示多酚氧化率降低92% compared to ambient drying. 工业化放大试验表明，连续生产线每小时可制备含200 mg石榴多酚的纳米颗粒制剂，成本较传统脂质体降低40%。

**局限性及未来方向**
研究未深入探讨不同pH或离子强度对载体稳定性的长期影响，后续需通过加速稳定性试验（ASTM D3412）评估。此外，针对特定疾病模型（如糖尿病）的靶向修饰机制尚不明确，建议结合表面配体修饰（如抗体偶联）开展生物相容性研究。未来可探索与其他载体（如壳聚糖纳米粒）的复合体系，以实现多通道递送。

该成果为开发基于全果多酚的磷脂体纳米制剂提供了理论依据和技术路径，其绿色制备工艺和高效包封特性对天然产物纳米递送系统研究具有里程碑意义。