靶向Snord115重复序列的多靶点锌指核酸酶通过持久沉默UBE3A-ATS实现Angelman综合征的基因治疗突破

《Gene Therapy》：Multi-targeting zinc finger nuclease vector unsilences paternal UBE3A in a mouse model of Angelman syndrome

　　本研究针对Angelman综合征（AS）治疗中反义寡核苷酸需反复注射、CRISPR/Cas9系统包装难度大且存在预存免疫等问题，开发了靶向Ube3a-ATS中Snord115重复序列的多靶点锌指核酸酶（ZFN）AAV载体。研究发现ZFN17/18可特异性整合至靶位点，有效敲低Ube3a-ATS并激活父源UBE3A表达达9周以上，且不影响Prader-Willi综合征相关基因。该研究为AS提供了更具持久性和安全性的基因治疗新策略。

　　

在神经科学领域，Angelman综合征（AS）一直是个棘手的难题。这种严重的神经发育障碍通常由母源遗传的UBE3A基因缺失引起。在神经元中，一个名为Ube3a-ATS的长链非编码RNA会像一把"基因锁"那样沉默父源UBE3A等位基因，使得母源UBE3A成为神经元中该蛋白的唯一来源。更棘手的是，当前进入临床试验的反义寡核苷酸（ASO）疗法需要反复进行鞘内注射，这对居住偏远地区的患者极为不便。

面对这一挑战，科学家们开始探索更持久的治疗方案。基因编辑技术为此带来了希望，但常用的CRISPR/Cas9系统因其较大的尺寸（约3-4kb）难以装入腺相关病毒（AAV）有限的包装容量（约4.6kb）中。此外，高达78%的人群对Cas9存在预存免疫力，这可能使相关疗法失效。这些限制促使研究人员将目光转向了更小巧的基因编辑工具——锌指核酸酶（ZFN）。

在这项发表于《Gene Therapy》的研究中，Hannah O. Bazick等研究人员设计了一种创新的解决方案。他们开发了靶向Ube3a-ATS中86个Snord115重复序列的多靶点ZFN对（ZFN17/18），并将其包装到单个双顺反子AAV载体中。相比于传统的单靶点策略，这种多靶点方法能更有效地敲低Ube3a-ATS的表达。

研究团队运用了多项关键技术：通过原代神经元培养模型进行体外筛选验证；利用AAV9载体介导的基因递送系统实现体内表达；采用免疫组织化学和Western blot技术检测UBE3A蛋白表达水平；通过RT-qPCR分析基因表达变化；设计体外切割/切口酶试验验证ZFN活性；并使用PROGNOS生物信息学工具预测脱靶效应。实验所用小鼠模型包括Ube3a^m+/pYFP和Ube3a^m-/p+两种基因型，均建立在C57BL/6J背景上。

多靶点锌指核酸酶在培养神经元中激活父源UBE3A

研究人员首先测试了八对靶向Snord115重复序列不同区域的ZFN对。通过瞬时转染到含有父源UBE3A-YFP报告基因的原代皮层神经元中，他们发现多个ZFN对能够有效激活父源UBE3A-YFP的表达。其中，ZFN28/29产生了最高比例的YFP阳性细胞，而ZFN17/18则使tdTom阳性细胞具有最高的平均YFP荧光强度。这些结果表明，针对Snord115重复序列的多靶点ZFN确实能够有效激活父源UBE3A。

活性锌指核酸酶优于切口酶和失活ZFN

研究团队进一步比较了活性ZFN、切口酶ZFN和催化失活ZFN的效果。他们通过点突变构建了不同类型的ZFN变体，并通过体外切割/切口试验验证了其功能。结果表明，只有活性ZFN能够在基因组DNA中产生双链断裂，并导致AAV载体在靶位点的整合。相比之下，切口酶ZFN仅能轻微降低Ube3a-ATS表达并激活父源Ube3a，而催化失活ZFN则几乎无效。这一发现强调了双链断裂在持久性基因激活中的关键作用。

p<0.05,p<0.01,p<0.001,**p<0.0001. Dashed line indicates normalized values of no virus control for each dataset.'>

多靶点ZFN17/18在Angelman综合征小鼠模型中激活父源UBE3A

在体内实验中，研究人员通过新生期脑室内注射将AAV9-ZFN17/18载体递送到AS模型小鼠的大脑中。令人振奋的是，治疗后9周，他们在大脑皮层、海马等多个脑区观察到了父源UBE3A的成功激活。皮层和海马区分别有20.5%和15.3%的神经元表达了UBE3A蛋白，且单个神经元的UBE3A蛋白强度达到了野生型小鼠的水平。

p<0.0001.F Mean UBE3A intensity per neuron in all mice. Line indicates average of each dataset.n=6-9 mice per condition;n=24,642-43,158 neurons per condition. One-way ANOVA, Tukey's multiple comparisons test to Wt Veh condition, per brain region;p<0.0001. G Western blot of(untagged) UEB3A protein levels in cortex of Wt and AS mice treated with Veh, or AS mice treated with AAV9:ZFN17/18. Loading control GAPDH.The average(avg.) ratio of UBE3A to GAPDH protein per group is reported. H RT-qPCR to evaluate expression of Ube3a-ATS adjacent to Ube3a(1-ATS and 2-ATS),Snord115,IPW,Snord116,Snrpn,and NeuN in AS mice following treatment with Veh or AAV9:ZFN17/18.Inset diagram illustrates primer binding sites along Ube3a-ATS transcript; numbering corresponds to numbering on graph x-axis. n=10-12 mice per condition. Unpaired two-tailed Student's t-test within each expression set; n.s. non-significant,**p<0.01.For(D,H),whiskers,min and max bounds of boxes, 25th and 75th percentiles; line within boxes, median.'>

重要的是，ZFN17/18治疗显著下调了Ube3a-ATS和Snord115的表达，但并未影响上游的IPW、Snord116或Snrpn基因的表达——这些基因的缺失与Prader-Willi综合征相关。这种特异性使得ZFN疗法相比某些表观遗传编辑方法具有明显优势。

该研究的讨论部分强调了ZFN作为AS治疗工具的独特价值。与需要反复给药的ASO疗法相比，基于核酸酶的基因编辑策略可能提供更持久的治疗效果。AAV载体在双链断裂位点的整合可能有助于转基因的长期表达，从而增强治疗的持久性。此外，ZFN的小尺寸使其更易于包装到AAV载体中，且不存在Cas9相关的预存免疫问题。

然而，研究人员也指出需要进一步探索的问题，包括插入突变的理论风险、在更长的时间尺度上评估治疗效果的持久性，以及在更接近人类的模型系统中验证治疗策略。特别值得注意的是，与其他报道的AS基因治疗方法相比，本研究实现的UBE3A激活水平（皮层18.5%）虽然相对较低，但研究人员观察到UBE3A激活与载体表达水平之间存在显著正相关，提示通过优化递送效率可能进一步提高治疗效果。

这项研究首次证明了ZFN在AS基因治疗中的应用潜力，为这种严重神经发育障碍的治疗提供了新的思路。相比于现有策略，ZFN-based疗法在持久性、安全性和递送效率方面展现出独特优势。随着后续研究的深入，这种多靶点ZFN策略有望发展成为临床可行的AS治疗方案，为患者带来新的希望。