氧化应激通过复制应激引发衰老个体成纤维细胞染色体不稳定性

《npj Aging》：Human fibroblasts from aged individuals exhibit chromosomal instability through replication stress caused by oxidative stress

　　本研究针对衰老相关染色体不稳定性(CIN)的机制展开探索，发现人类衰老成纤维细胞中由线粒体功能障碍导致的氧化应激会诱发复制应激，进而通过微管稳定化途径引起CIN。该研究揭示了氧化应激-复制应激-CIN轴在人类细胞衰老过程中的保守机制，为理解年龄相关的基因组不稳定性和癌症发生提供了新视角。

　　

随着全球人口老龄化加剧，理解衰老的细胞分子机制已成为生命科学领域的焦点课题。基因组不稳定性作为衰老的核心标志之一，其最显著的表现形式——染色体数目异常（非整倍体）在衰老个体中明显增加。虽然科学家们早已发现卵母细胞中与母亲年龄相关的染色体异常现象，但体细胞随着年龄增长出现的非整倍体增加及其背后机制仍待深入探索。

此前， Tanaka 团队在小鼠模型中取得重要发现：衰老小鼠的原代成纤维细胞表现出染色体不稳定性(CIN)，这种现象与氧化应激密切相关。然而，一个关键问题悬而未解：人类细胞是否遵循相同机制？尤其考虑到人类细胞比小鼠细胞对氧化应激具有更强抵抗性——人类成纤维细胞能在20%氧气环境下增殖50代以上，而小鼠细胞则会快速生长停滞。这种物种差异使得探索人类细胞衰老过程中染色体稳定性变化规律变得尤为重要。

近日发表在《npj Aging》上的研究给出了答案。Kailin Zhu、Guan Chen、Yueyi Ren、Kenji lemura和Kozo Tanaka团队发现，来自衰老个体的人类成纤维细胞同样表现出染色体不稳定性，其机制与小鼠模型惊人地相似：氧化应激引发复制应激，进而通过微管稳定化导致染色体错误分离。这一发现揭示了哺乳动物细胞衰老过程中染色体不稳定性形成的保守机制。

研究人员主要运用了以下关键技术：从美国老龄化研究所细胞库获取不同年龄供体的成纤维细胞进行培养；通过染色体计数和微核分析评估染色体稳定性；利用活细胞成像观察有丝分裂过程；采用DNA纤维 assay直接测量复制叉进程；通过免疫荧光检测53BP1核体和超细桥(UFBs)等复制应激标志物；使用CellROX和MitoSOX探针检测活性氧(ROS)水平；借助JC-10染料评估线粒体膜电位；并利用冷处理实验分析微管稳定性。

人类衰老个体成纤维细胞呈现染色体不稳定性

研究团队从美国国家老龄化研究所细胞库获得了年轻和衰老个体来源的皮肤和肺成纤维细胞。细胞增殖实验显示，衰老个体来源的细胞生长速度明显减慢。染色体计数分析揭示，衰老个体细胞中非整倍体细胞比例显著增加，虽然染色体众数仍为46条，但偏离正常数目的细胞明显增多。

为进一步探究非整倍体增加的原因，研究人员观察了染色体错误分离现象。微核形成率在衰老个体细胞中升高，固定细胞样本中滞后染色体和染色体桥的发生率也增加。活细胞成像结果证实，衰老个体细胞有丝分裂过程中染色体错误分离事件更为频繁。有趣的是，衰老个体细胞的前中期和整个有丝分裂持续时间均延长，但纺锤体组装检查点(SAC)活性并未改变，因为其在微管破坏药物处理下的有丝分裂停滞时间与年轻细胞无差异。

衰老个体成纤维细胞处于复制应激状态

DNA损伤反应标志物γ-H2AX焦点数在衰老个体细胞中增加，表明DNA双链断裂增多。更重要的是，研究人员观察到大而少的53BP1核体，这是复制应激的特征性标志。同时，后期细胞中超细桥(UFBs)的出现频率增加，染色体铺片显示染色体断裂增多，这些都提示复制应激的存在。

为直接证实复制应激，团队进行了DNA纤维实验，结果显示衰老个体细胞中复制叉推进速度显著减慢，姐妹复制叉不对称性增加，明确证实了DNA复制过程受阻。

线粒体功能障碍导致氧化应激

通过CellROX Green和MitoSOX Red检测，发现衰老个体细胞中总ROS和线粒体超氧化物水平均升高。JC-10染料检测显示线粒体膜电位降低，表明线粒体功能下降。抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理能降低ROS水平，并部分恢复线粒体膜电位，提示氧化应激与线粒体功能障碍密切相关。

抗氧化处理缓解染色体不稳定性

为验证氧化应激与CIN的因果关系，研究人员用NAC处理细胞。结果显示，NAC处理显著降低了微核形成率和染色体错误分离率。在更接近生理条件的3%氧气环境下，衰老个体细胞仍表现出较高的染色体错误分离率，且能被NAC进一步改善，表明氧化应激是衰老相关CIN的真正原因而非细胞培养假象。

复制应激是氧化应激引发CIN的上游事件

NAC处理减少了γ-H2AX焦点、53BP1核体和超细桥，表明抗氧化能缓解复制应激。为直接证明复制应激与CIN的因果关系，团队用核苷补充部分挽救复制应激，结果显示复制应激标志物减少的同时，微核形成率也下降，而ROS水平未改变，证实复制应激位于氧化应激下游、CIN上游。

微管稳定化是CIN的关键机制

冷处理实验显示，衰老个体细胞中纺锤体微管稳定性增加。NAC处理和核苷补充均能降低微管稳定性，表明氧化应激和复制应激导致微管稳定化。用微管去稳定化化合物UMK57处理细胞，增加微管动力学后，微核形成率下降，而复制应激标志物未改变，证实微管稳定化是复制应激引发CIN的关键环节。

研究结论表明，人类成纤维细胞在衰老过程中出现的染色体不稳定性是由氧化应激-复制应激-微管稳定化轴介导的。尽管人类细胞对氧化应激的耐受性高于小鼠细胞，但这一机制在两种物种中保守存在，揭示了哺乳动物衰老过程中基因组不稳定性形成的共同分子通路。

这项研究的深刻意义在于，它将氧化应激、复制应激和染色体不稳定性这三个衰老和癌症研究中的核心概念有机串联，为理解年龄相关的基因组不稳定性提供了全新视角。特别值得注意的是，尽管衰老个体细胞中非整倍体细胞增加，但染色体众数保持不变，提示存在有效机制阻止非整倍体细胞增殖，可能由p53等因子介导。当这些保护机制失效时，年龄相关的CIN可能通过传播非整倍体细胞促进肿瘤发生。

该研究不仅深化了对人类细胞衰老机制的理解，也为开发针对年龄相关疾病（包括癌症）的干预策略提供了潜在靶点。然而，如何精确调控ROS水平至适宜范围以维持染色体稳定性同时不影响细胞正常功能，仍是未来研究的重要方向。