综述：可视化液-液相分离和蛋白质聚集体

《Communications Chemistry》：Visualizing liquid-liquid phase separation and protein aggregates

　　本综述系统评述了液-液相分离（LLPS）与蛋白质聚集体的成像技术前沿，重点介绍了荧光显微术（如FRAP）、冷冻电镜（cryo-EM）等工具在揭示tau蛋白、α-突触核蛋白（α-Syn）等从液态凝聚态到病理性淀粉样纤维（amyloid fibrils）动态转化过程中的突破性应用，为神经退行性疾病（如阿尔茨海默病AD、帕金森病PD）机制研究提供了关键方法学支持。

　　

液-液相分离与蛋白质聚集的可视化研究进展

液-液相分离成像技术概述

液-液相分离（LLPS）是生物大分子（如蛋白质或RNA）通过弱多价相互作用形成无膜细胞器的关键过程。该现象与细胞功能调控和神经退行性疾病的发生密切相关。成像技术的突破使得直接观察LLPS动态过程及后续蛋白质聚集成为可能。传统生化手段如核磁共振（NMR）和质谱可定量分析LLPS的物理参数（如扩散系数），但无法实现实时可视化。显微镜技术尤其是荧光显微术，已成为研究LLPS结构与生物物理特性的核心工具。

体外重构与LLPS成像

体外重构是研究LLPS机制的重要模型。通过改变盐浓度、pH或温度等条件驱动目标蛋白质（如tau或FUS）发生相分离，可结合浊度测定与显微镜技术追踪液滴形成。亮场显微镜和荧光显微镜是最常用工具：

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  差异干涉对比（DIC）成像可观察液滴形态；
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  荧光标记可定量稠密相浓度；
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  荧光漂白恢复（FRAP）技术能分析液滴内分子动态。
  例如，Combs等研究发现，在分子拥挤剂PEG存在下，tau蛋白在生理浓度下形成液滴，而FRAP实验显示FUS液滴随时间的推移从液态转化为不可逆的纤维状聚集体。

细胞内LLPS成像

细胞内LLPS成像可揭示生理相关性。核仁是最早发现的无膜区室，后续研究在真核细胞核与胞质中观察到类似结构。FRAP技术通过光漂白后荧光恢复曲线评估凝聚体的液态性质。例如，Young等发现转录共激活因子BRD4和MED1在超增强子处形成液滴状核斑点，其快速荧光恢复证实了液态特性。此外，光遗传学方法通过光控蛋白质聚合模拟细胞内LLPS过程，但需注意光诱导交叉连接可能造成假凝胶化。

蛋白质聚集体的显微成像

蛋白质聚集体（尤其是淀粉样纤维）的结构决定其病理功能。冷冻电镜（cryo-EM）可在原子水平解析纤维核心结构，如hnRNPA2蛋白的纤维核心具有刚性而外围结构灵活。负染透射电镜（NS-TEM）结合免疫金标记可可视化α-突触核蛋白纤维与受体vRAGE的结合。研究发现，某些淀粉样纤维（如hnRNPA1）具有可逆性，温度变化可诱导其从纤维态转变为液滴态。

聚集过程中蛋白质构象变化的监测

单分子FRET和荧光相关光谱（FCS）可实时追踪蛋白质构象演变。例如，tau蛋白在LLPS过程中其N端与C端延伸，暴露出微管结合区域，促进淀粉样纤维形成。时间分辨冷冻电镜揭示了人胰岛淀粉样多肽（IAPP-S20G）在纤维组装滞后期、生长期和平台期的多态性结构演变。超分辨率显微技术（如STORM、PALM）进一步在纳米尺度解析了Aβ₄₂纤维生长的分子有序性。

生物分子凝聚体的理化性质成像

环境敏感荧光探针（如ACDAN）可通过光谱相量分析绘制蛋白质不同相态的微环境图谱。光学镊子与微吸管 aspiration 技术可定量凝聚体的表面张力与黏弹性，揭示其类液体/类固体双重特性。研究表明，微极性梯度驱动无膜细胞器的分层结构组装，而疏水性核心可调控其与生物膜的相互作用。此外，凝聚体内部pH可通过基因编码的荧光蛋白报告基因进行成像，为生理功能研究提供新视角。

挑战与展望

当前技术尚难以同步监测LLPS全过程与蛋白质聚集的分子演变。细胞内研究多依赖蛋白质过表达，生理条件下的原位成像仍是挑战。未来需开发单分子水平定量技术，结合微流体、无标记成像等方法，推动神经退行性疾病的早期诊断与治疗策略创新。