1q增益通过野生型共培养拯救绕过非整倍体在RPE分化中的选择性屏障

《Nature Communications》：1q gain bypasses the selective barrier against aneuploidy in RPE differentiation via wild-type co-culture rescue

　　本研究针对人多能干细胞(hPSC)分化过程中频繁出现的染色体异常问题，聚焦视网膜色素上皮(RPE)分化这一临床常用细胞类型。研究人员发现1q染色体臂增益的非整倍体细胞能通过野生型细胞的旁分泌信号成功分化为RPE，并在分化过程中获得竞争优势，这对干细胞治疗的安全性评估具有重要意义。

　　

在再生医学快速发展的今天，人多能干细胞(hPSC)衍生细胞治疗为多种退行性疾病带来希望，其中视网膜色素上皮(RPE)细胞已成为治疗年龄相关性黄斑变性和斯塔加特氏黄斑营养不良等视网膜疾病最常用的细胞类型之一。目前全球已有百余项相关临床试验正在进行或已完成。然而，hPSC在体外培养过程中易积累染色体异常，如1号、12号、17号和20号染色体的片段或整体增益，这些异常与癌细胞中的突变相似，对治疗安全性构成潜在威胁。

尽管临床前会对hPSC及其衍生细胞产品进行遗传学筛查，但常规方法如G带分析和大规模平行测序(MPS)难以检测低级别嵌合型非整倍体。而研究表明，hPSC培养物中普遍存在3%-6%的细胞携带不同非整倍体。这些"隐形"的遗传异常细胞在分化过程中可能因选择性压力被淘汰，也可能获得生长优势而富集，影响最终细胞产品的有效性和安全性。

为此，由Edouard Couvreu de Deckersberg和Yingnan Lei作为共同第一作者，Claudia Spits作为通讯作者的研究团队在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。他们通过单细胞DNA测序(scDNAseq)、单细胞RNA测序(scRNAseq)等多种先进技术，系统研究了不同非整倍体在hPSC向RPE自发分化过程中的命运变化，揭示了1q增益细胞独特的生物学行为及其机制。

关键技术方法包括：使用单细胞DNA测序(scDNAseq)分析hPSC的遗传组成；通过单细胞RNA测序(scRNAseq)追踪分化过程中的转录组变化；利用inferCNV算法从scRNAseq数据推断拷贝数变异(CNV)；应用SCENIC进行调控网络分析；采用配体-受体相互作用分析细胞间通讯；建立荧光标记共培养系统研究细胞竞争；通过免疫荧光染色评估RPE特异性标志物表达。

hESC产生具有细胞系特异性特征的神经细胞

研究人员使用非指导性协议将遗传平衡的人胚胎干细胞(hESC)分化为RPE。分化4-8周后，出现色素沉着区域，表明细胞自发分化为RPE。这些色素簇被分离传代获得纯化RPE培养物。RGB谱系追踪系统显示色素集落主要为单克隆起源。单细胞转录组分析显示，除了RPE和视网膜祖细胞外，还存在皮质缘、少突胶质祖细胞、无长突细胞和视网膜神经节细胞等其他神经细胞类型，以及羊膜样细胞群体。这些非RPE细胞类型通过集落挑选和传代被排除。纯化后的RPE培养物呈现典型铺路石形态，表达PMEL、ZO-1、BEST1等RPE标志物，而不表达多能性标志物NANOG。

RPE分化消除非整倍体细胞，但1q增益例外

单细胞DNA测序显示，假定遗传平衡的hESC培养物中含有3%-6%的染色体异常细胞，包括具有混乱遗传内容的细胞和已知可赋予生长优势的复发性非整倍体。活细胞成像证实hESC经历异常的多极分裂，产生具有混乱遗传内容的子细胞。分化终点inferCNV分析发现，与未分化的hESC不同，RPE中唯一的遗传失衡是不同大小的1q增益，存在于所有细胞系中。计算表明，其他非整倍体的缺失并非随机集落挑选的结果，表明RPE分化构成了针对大多数非整倍体细胞的强选择性瓶颈，而1q增益可能在此过程中赋予细胞培养优势。

1q增益RPE显示轻微转录组差异

携带大片段1q增益的RPE细胞(RPE1q)表达所有预期的RPE标志物，表明它们分化为真正的RPE细胞。单细胞基因集变异分析(scGSVA)显示，尽管许多KEGG通路达到高度统计学显著性，但标准化富集评分的平均差异极小。除凋亡通路外，其他基因集的变化主要归因于细胞系间变异而非1q增益的存在。PARP1、MCL1和LMNA等位于1q增益区域的凋亡过程执行基因在RPE1q细胞中显著上调，表明其拷贝数增加可能驱动了更高表达和凋亡通路失调。

共培养拯救1q增益hESC的受损RPE分化

除小的局灶性1q32.21增益外，其他非整倍体hESC细胞系均无法正确分化为RPE。共培养实验显示，20三体和iso20q克隆逐渐耗竭，而1q增益细胞在分化过程中具有竞争优势。转录轨迹分析表明，当与野生型细胞共培养时，1q增益细胞紧密跟随野生型分化轨迹，而20三体和iso20q细胞在生长因子撤除后前两天就发生偏离。SCENIC分析揭示了不同核型和时间点的独特调节子活性模式。配体-受体相互作用分析发现，野生型细胞分泌的参与神经外胚层模式的配体-受体对存在于野生型与1q增益细胞的通讯中，而iso20q和20三体细胞呈现不同的受体配置，表达高水平的维持多能性的配体及其受体。

1q RPE在分化过程中具有竞争优势但显示非整倍体相关应激

共培养实验证实，1q增益细胞在分化过程中快速超越遗传平衡对应物，在分化终点占总分化细胞的9%至24.9%。这些细胞表达ZO-1、PMEL、PAX6和BEST1等关键RPE标志物，与对照细胞相似。批量RNA测序显示，RPE1q细胞与RPEwt相比有372个基因上调和1183个基因下调。基因集富集分析表明，RPE1q细胞显示凋亡通路、未折叠蛋白反应、DNA修复和p53信号通路等通常由非整倍体触发的细胞内应激反应过程失调。

共培养不拯救20q非整倍体细胞的分化

20q11.21增益细胞在自发分化过程中比例稳步增加，iso20q比例先增加后稳定最终下降。纯化的RPE群体中分别有3%和5%的细胞携带20q11.21增益或iso20q，但这些非整倍体细胞显示异常的PMEL表达。表明虽然20q11.21增益细胞在自发分化过程中能竞争过遗传平衡细胞，但大多数正确指定的RPE源于遗传平衡细胞。

该研究揭示了自发RPE分化作为针对非整倍体细胞的纯化瓶颈，但1q增益细胞例外。这些细胞在与遗传平衡细胞共培养时可成功分化为RPE，仅显示轻微的非整倍体相关应激特征。研究强调了hPSC培养物中低级别嵌合型非整倍体的存在及其在分化过程中的选择性富集，对干细胞治疗的安全性评估具有重要意义。尽管RPE具有低致瘤性，且尚无临床试验报道肿瘤发生，但hPSC中嵌合型非整倍体的普遍性强调了安全措施的必要性，如靶向消除非整倍体细胞或合成杀伤开关。严格的基因组监测和功能保障对于确保移植细胞的遗传完整性和谱系保真度至关重要。