基于单玫瑰花结生成均匀皮层组装体以模拟神经元与胶质细胞间相互作用

《Nature Communications》：Single rosette-based generation of uniform cortical assembloids recapitulating cellular interactions between neurons and glial cells

　　本研究针对当前脑类器官技术存在的异质性高、皮质层结构不完整及神经元-胶质细胞相互作用不成熟等关键问题，开发了一种模块化细胞重构技术。研究人员通过早期生成单玫瑰花结结构、封装Reelin(RELN)表达神经元层以及微注射胶质细胞等步骤，成功构建出高度均匀、具有六层皮质结构和功能连接的皮层组装体(cortical assembloids)。该模型在转录组和功能层面均与发育中的人脑高度相似，为研究神经系统疾病提供了创新的临床前模型。

　　

在当今神经科学研究领域，三维脑类器官技术为模拟人脑发育和疾病机制带来了革命性突破。然而，这一前沿技术正面临着两大核心挑战：类器官间的异质性过高导致实验结果难以重复，以及现有模型难以真实再现人脑复杂的细胞多样性和功能性连接。特别是在传统多玫瑰花结(multi-rosette)脑类器官中，神经上皮样结构的数量和大小难以控制，加上关键信号分子如Reelin(RELN)的时空表达调控不足，使得类器官的皮质层状结构发育不完整，神经元与胶质细胞间的动态相互作用更是难以实现。

针对这些技术瓶颈，来自首尔国立大学分子生物学与遗传学研究所的Kunyoo Shin教授团队在《Nature Communications》上发表了创新性研究成果。他们开发了一种逐步模块化细胞重构技术，成功生源于单玫瑰花结的均匀皮层组装体(cortical assembloids)，这一新型模型不仅解决了异质性问题，更首次在类器官中实现了六层皮质结构的功能性重演。

关键技术方法包括：利用hPSC来源的胚胎体通过悬浮培养和基质胶包裹形成神经上皮结构；通过Wnt和Hedgehog(Hh)信号通路激动剂(CHIR99021和SAG)处理促进神经前体细胞(NPC)增殖；手动解剖获得单玫瑰花结结构；封装表达RELN的工程化神经元；通过微注射技术整合星形胶质细胞和小胶质细胞。研究团队对13个皮层组装体进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析，并与11个已发表的皮层类器官数据集进行比较，同时采用免疫荧光染色、多电极阵列(MEA)记录、钙成像和全细胞膜片钳等技术进行功能验证。

创建皮层组装体的模块化细胞重构策略

研究团队设计了一个精密的四步法构建流程。首先，从人多能干细胞(hPSC)生成胚胎体(EB)，通过神经诱导培养基和基质胶包埋促进神经外胚层分化。在第25-32天，使用CHIR99021(Wnt激动剂)和SAG(Hh激动剂)处理，显著增加了SOX2阳性NPC数量、脑室区(VZ)厚度和玫瑰花结大小。随后，研究人员创新性地通过手动解剖获得单玫瑰花结结构，这些结构具有单一腔室并保持正确的顶端极性，尺寸均匀且批次间差异小。

在关键步骤中，团队将五个尺寸最接近中值的单玫瑰花结类器官与表达RELN的神经元共同封装。这些工程化神经元表现出谷氨酸能神经元特征(MAP2、VGLUT1、P73阳性)，模拟了发育中人脑皮质发生早期迁移至边缘区(后来形成第1层)的Cajal-Retzius细胞。最后，通过微注射技术将hPSC来源的星形胶质细胞和小胶质细胞注入皮层组装体的外皮质层，经过30天的成熟培养，最终形成具有细胞多样性和最小批次效应的高度均匀皮层组装体。

皮层组装体重现人脑六层皮质结构

免疫染色分析显示，皮层组装体中的神经元具有成熟的锥体形态，具有复杂的树突结构和神经元投射，且呈现自发性动作电位。更重要的是，这些神经元呈现放射状排列，轴突投射跨越皮质层，从最外层到皮层组装体的皮质内区域。

通过皮质层特异性标志物免疫染色，研究团队观察到从第6层到第1层的分层分布结构，包括深层神经元标志物TBR1(第6层)和CTIP2(第5层)，以及上层神经元标志物SATB2(第4层)、BRN2(第3层)、CUX2(第2层)和RELN(第1层)。定量分析证实，重组表达的RELN神经元持续位于皮层组装体外表面，形成关键的第一神经元层。

胶质细胞分析显示，GFAP阳性星形胶质细胞具有高度复杂性，包含纤维状(8.5%)、原生质(44.0%)和层间(47.5%)三种形态亚型，并与神经元形成三联体突触。IBA1阳性小胶质细胞则呈现阿米巴样到分枝状形态，表明其处于活跃和静息状态，并在皮层组装体内活跃移动，表现出吞噬和重塑神经元突触的潜在功能。

皮层组装体呈现自发性神经活动和功能连接

功能研究表明，皮层组装体中存在大量VGLUT1(突触前)和PSD95(突触后)共定位的突触 puncta。钙成像分析显示，多个神经元中出现自发性钙瞬变，平均每分钟3-4次。细胞外记录显示，皮层组装体具有稳健的电活动，特征为离散动作电位和去极化，爆发频率平均为0.33 Hz，爆发间隔(IBI)为3.04秒。

同步性分析进一步证实，皮层组装体在单细胞水平和群体水平均表现出高度同步的钙活动。MEA记录显示，多个通道间存在高度同步的神经活动，呈现周期性、规律性振荡的网络爆发事件，平均网络爆发频率为0.3 Hz。这些功能特征与发育中人脑的复杂时空动力学高度相似，表明皮层组装体已建立功能性神经元网络。

皮层组装体在单细胞水平重现人脑细胞组成和转录组

为在转录组水平评估皮层组装体的成熟度和细胞复杂性，研究团队进行了大规模单细胞RNA测序比较分析。结果显示，皮层组装体包含前脑谱系的七种转录 distinct 细胞类型：放射状胶质细胞(RG)、分裂RG、中间祖细胞(IPC)、兴奋性神经元、少量抑制性神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞。

更重要的是，皮层组装体的细胞组成和转录谱与晚期胎儿期人脑高度相关。兴奋性神经元分析显示，皮层组装体产生了与每个皮质层相对应的细胞群体，且各层兴奋性神经元的发育轨迹遵循从第6层到第2层的顺序，与人脑皮质发育的时间模式高度一致。

与皮层组装体相比，已发表的皮层类器官主要由RG、分裂RG、兴奋性神经元和少量抑制性神经元组成，星形胶质细胞比例较低，且完全缺乏小胶质细胞。这些类器官中的兴奋性神经元主要表现为深层特性(第5层和第6层)，上层神经元比例较低，且缺乏某些层特异性上层神经元，导致无法完整对应所有六个皮质层。互信息(MI)评分分析进一步证实，皮层组装体在不同批次和细胞系间具有高度一致性，而异质性分析表明，现有皮层类器官即使使用相同方案生成，个体间也存在较大变异。

研究结论与意义

本研究通过逐步重构技术，包括早期生成单玫瑰花结类器官和后续空间重构RELN表达神经元层及非神经元胶质细胞，成功创建了均匀、成熟的皮层组装体。这一创新模型解决了当前脑类器官技术面临的主要异质性问题，实现了六层皮质结构的功能性重演，并建立了神经元与胶质细胞间的动态相互作用。

皮层组装体在结构、功能和转录组层面均表现出与发育中人脑高度相似的特征，包括完整的层状组织、功能性突触连接、同步神经活动以及丰富的胶质细胞组成。这一高度优化的模型为研究神经发育障碍和神经系统疾病中复杂的细胞相互作用提供了强大平台，也为开发患者特异性治疗方案奠定了坚实基础。

尽管皮层组装体在抑制性神经元数量和规模化生产方面仍存在局限，但其在均匀性、成熟度和功能性方面取得的突破，标志着脑类器官技术向精准模拟人脑复杂性迈出了重要一步。未来研究可进一步优化抑制性神经元的整合策略，并开发可扩展的生产方案，使这一创新技术更广泛应用于基础研究和药物筛选领域。