针对高通量酵母遗传变异工程，对Cas12a变体的PAM（Protein-Alphavirus-Mediated）兼容性进行基准测试

《Applied and Environmental Microbiology》：Benchmarking the PAM compatibility of Cas12a variants for high-throughput yeast genetic variant engineering

　　本研究开发了一种高效的同源整合CRISPR/Cas12a系统，通过优化Cas12a变体（impLbCas12a）和设计T-rich PAM序列，显著扩展了在酵母中的靶向范围。实验表明，该系统在 canonical和 non-canonical PAMs（如TNTN、TACC等）上具有高编辑效率和纯度（>80%），并成功应用于多组学饱和突变体筛选和双基因编辑，为酵母基因组工程提供了新工具。

　　
近年来，CRISPR/Cas系统在微生物基因编辑领域中的应用不断拓展。针对酿酒酵母（*S. cerevisiae*）这一模式生物，研究者们尝试开发更高效的基因编辑工具以应对其基因组特性带来的挑战。酵母基因组具有高AT含量（约61.5%），而传统CRISPR/Cas9系统依赖NGG型PAM序列（G富集型），导致约38.5%的基因组区域无法被有效靶向。这一局限性严重制约了通过基因编辑手段对酵母功能基因组进行系统性研究。

### 研究背景与核心问题
Cas9系统在酵母中虽已广泛应用，但其严格的PAM依赖性（NGG）限制了编辑效率。尽管已有研究通过改造Cas9蛋白（如SpG、SpRY等）放宽PAM限制，但普遍存在编辑效率下降的问题。与此同时，Cas12a系统因靶向TAR型PAM序列（TAA或TTT）而备受关注，其独特的切割机制（产生粘性末端）和单链crRNA结构可能更适配酵母的HDR修复机制。然而，Cas12a在酵母中的实际应用仍面临多重挑战：首先，野生型Cas12a的TAA型PAM覆盖范围有限；其次，多组学编辑时crRNA阵列的表达稳定性不足；再者，线性修复供体难以实现高通量编辑。

### 创新解决方案与技术突破
研究团队构建了基于LbCas12a的改良型酶impLbCas12a，通过定向进化引入D156R、G532R、K538V等多点突变，显著拓宽了PAM识别范围。实验数据显示，impLbCas12a可在酵母中有效靶向TNTN、TACV、CTCV等18种非典型PAM序列，其中TNTN型PAM的编辑效率达到40%以上，部分新型PAM（如TACC、TTCC）的编辑效率超过80%。该变体在TCTA和TCTC型PAM下的编辑效率较同类变体（如LbCas12a-3Rv）提升2-3倍，且编辑纯度超过90%。

系统设计方面，创新性地采用同源整合策略（HI-CRISPR），将同源重组供体直接整合至crRNA表达载体3'端。这种单载体设计不仅简化了操作流程（将传统Cas9系统的多步骤整合简化为一步完成），更显著提高了编辑效率。比较实验表明，impLbCas12a系统在ADE2基因编辑中的效率（95%）较野生型LbCas12a（78%）提升23%，且无需液氮培养即可实现高效编辑。

### 关键实验结果与发现
1. **PAM兼容性验证**：通过构建包含226种TAA型PAM的酵母突变库，系统验证了impLbCas12a在35种非典型PAM（占测试总量的15.4%）下的编辑活性。其中TATM型PAM的编辑效率达到100%，而LbCas12a-3Rv在此条件下仅显示3%的效率。特别值得注意的是，该系统在CTCC（胸腺嘧啶-胸腺嘧啶-胞嘧啶-胞嘧啶）型PAM下的编辑效率达到82%，突破了传统Cas12a系统在酵母中应用的技术瓶颈。

2. **编辑窗口动态特性**：通过设计梯度距离供体（从5bp到35bp），发现编辑效率在距离酶切位点20bp范围内（±20bp）达到峰值（85-92%）。这与Cas9系统在酵母中15-25bp的编辑窗口形成互补，为构建更宽泛的靶向范围提供了新可能。

3. **多组学编辑突破**：在PfDHFR基因（疟原虫二氢叶酸还原酶）编辑中，成功实现C59R和S108N两个位点的协同编辑。通过设计AAAT型分隔序列，使双编辑效率稳定在78-85%区间，较传统方法提升40%。特别是在E236*（终止密码子插入）的编辑中，双突变株T107R+E236*的抗药性较单一突变提升2.3倍，为多靶点协同进化研究提供了新工具。

### 技术优势与应用前景
相较于SpCas9系统，该Cas12a方案具有三重优势：
- **靶向范围扩展**：从NGG型（约61.5%基因组可用）扩展至TNTN型（覆盖85.2%酵母基因组）
- **编辑效率提升**：平均编辑效率达89.7%，较改良SpCas9（SpG）系统提高15-20个百分点
- **操作流程简化**：单载体系统将传统Cas9的7天周期缩短至4天，且无需额外液氮培养

在应用层面，已成功构建覆盖20种氨基酸的突变库（NNK库），单次实验即可完成5个连续密码子的全变异扫描。通过设计反向互补crRNA阵列（最大表达量达12.8 kb），成功实现4个基因的多靶点编辑，其中双编辑效率达72.3%，较单编辑提升1.8倍。

### 潜在局限与发展方向
当前系统仍存在两个主要限制：其一，部分TAR型PAM（如TTTT、TGGT）的编辑效率低于15%；其二，crRNA阵列设计对载体容量有刚性约束（目前最大支持8个crRNA）。未来研究可考虑以下方向：
1. **复合PAM识别机制**：开发同时识别TNTN和TCTC型PAM的嵌合酶
2. **时空可控编辑**：结合TEF1p诱导型启动子实现分阶段crRNA表达
3. **宿主泛化性研究**：已在毕赤酵母（*P. pastoris*）中验证了载体系统的兼容性，编辑效率达野生型LbCas12a的78%
4. **编辑精度优化**：通过引入终止密码子前移策略（如TAA→TTA转换），将非预期编辑降低至0.3%以下

该技术体系为构建酵母功能基因组图谱提供了新的解决方案，特别适用于：
- 代谢通路定向进化（如工程化核糖体蛋白）
- 抗逆性基因多组学编辑（抗紫外线、重金属等）
- 表观遗传调控元件发现
- 工业酵母菌株定制化改造

研究团队已建立包含1,200+突变体的标准化酵母库，并通过机器学习算法（CRISPOR 2.0）实现了crRNA设计的自动化优化。这种技术框架不仅适用于基础研究，更为合成生物学在酵母底盘上的应用开辟了新路径。据估算，该系统可使药物靶点基因（如DFR1）的理性设计周期从6个月压缩至8周，显著提升了生物制造产业的研发效率。