HFPO-DA和PFOA与镉（Cd）共同作用时对草履虫表现出不同的毒性效应：包括其生长、行为以及分子层面的变化

　　本研究通过14天慢性暴露实验，比较了双（六氟丙基）氧代环丙烷二羧酸（HFPO-DA）与全氟辛酸（PFOA）在镉（Cd）污染条件下的联合毒性效应。结果表明，HFPO-DA与Cd共暴露显著增强膜通透性，促进Cd生物有效性，加剧氧化应激和细胞凋亡，导致能量代谢（ATP水平下降、三羧酸循环相关基因下调）和纤毛运动（动力蛋白基因及微管蛋白基因抑制）双重抑制，使P. duboscqui的生长抑制和运动障碍效应比单一暴露更严重。转录组学分析揭示PFASs与Cd协同干扰能量代谢和氧化磷酸化途径，证实HFPO-DA的毒性可能超越PFOA。

　　
### 研究背景与意义
近年来，全氟化合物（PFASs）作为持久性有机污染物，因其环境持久性和生物累积性引发全球关注。其中，全氟辛酸（PFOA）因致癌性和生态毒性被严格限制，而替代品六氟丙酮氧化物二酸（HFPO-DA，俗称GenX）因成本低、易获取而被广泛应用。然而，HFPO-DA与PFOA的毒性是否等同，尤其在重金属共污染条件下的联合效应仍不明确。草履虫（*Paramecium duboscqui*）作为近缘物种，具有易培养、基因组数据完善且对环境污染物敏感的特点，成为研究PFASs与重金属协同毒性的理想模型。

### 研究目标与方法
本研究以草履虫为对象，模拟环境中PFASs与Cd（镉）共存在的实际浓度（Cd：50 μg/L；PFOA/HFPO-DA：1 μg/L），通过14天慢性暴露实验，评估单因子及联合暴露对以下指标的影响：
1. **生长与形态学**：监测种群数量、生物量及细胞形态异常率。
2. **生理生化参数**：测定膜通透性、氧化应激（ROS、MDA）、抗氧化酶（SOD、CAT、GPX）活性及ATP水平。
3. **行为学**：分析游泳行为参数（移动距离、平均及最大速度）。
4. **转录组学**：利用RNA测序解析PFASs与Cd共暴露下的分子机制。

实验采用三组重复，并通过诱导 pluripotent stem cell (iPSC) 技术验证关键基因表达，结合生物信息学工具（如GSEA、GO/KEGG富集分析）解析毒性通路。

### 关键发现
1. **生长抑制与形态异常**
- 单独暴露：PFOA和HFPO-DA均显著抑制草履虫生长（14天暴露后生物量减少达21.2%），且HFPO-DA的毒性略高于PFOA。
- 联合暴露：Cd与PFASs共暴露加剧生长抑制，其中Cd+HFPO-DA组生物量较对照组下降34.5%，显著高于Cd+PFOA组（28.1%）。
- **形态学**：所有处理组均出现细胞扭曲和食物泡异常增大，其中HFPO-DA+Cd组异常率达20±2.5%，高于PFOA+Cd组（17±3%）。

2. **膜通透性与氧化应激**
- **膜损伤**：HFPO-DA单独暴露组膜通透性升高2.3倍，联合Cd暴露时达4.1倍（PFOA组为2.8倍）。荧光染色显示细胞膜脂质过氧化产物MDA水平在HFPO-DA+Cd组最高（较对照组增加3.08倍）。
- **氧化应激**：联合暴露显著升高ROS水平（HFPO-DA+Cd组较单暴露组增加42%），并抑制抗氧化酶活性（SOD、CAT、GPX活性下降15%-30%）。ATP水平与膜通透性呈负相关（r=0.87, P<0.001），表明能量代谢受阻是毒性核心机制。

3. **行为学改变与能量代谢关联**
- **游泳行为**：HFPO-DA+Cd组草履虫移动距离减少23.4%，平均速度下降14.6%，最大速度降低2.99%，且与ATP含量呈显著正相关（r=0.76, P<0.01）。
- **能量代谢通路**：转录组分析显示，PFASs与Cd共暴露导致糖酵解关键基因（*pgk*）和三羧酸循环（*cs*基因）表达下调，同时脂肪酸β-氧化相关基因（*lacs4*）在HFPO-DA+Cd组上调1.5倍，表明细胞通过代谢重编程试图补偿能量缺口。

4. **分子机制解析**
- **线粒体功能障碍**：OXPHOS复合物IV亚基（*cox15*）和复合物I亚基（*ndufa12*）在联合暴露组中表达下调2-3倍，ATP合成效率降低。
- **纤毛运动调控**：纤毛动力蛋白相关基因（*dyh1, 3, 6, 7, 12*）及微管蛋白（*tba3*）表达显著抑制，导致纤毛结构破坏和运动能力丧失。
- **凋亡与自噬失衡**：联合暴露组中促凋亡基因（*apaf-1*）上调1.8倍，抗凋亡基因（*bi1*）下调2.3倍，且自噬基因（*atg1*）在HFPO-DA+Cd组中表达最高（3.2倍），提示细胞通过自噬和凋亡双重路径响应毒性。

### 环境与生态学意义
1. **协同毒性增强**：HFPO-DA通过破坏细胞膜完整性（增加Cd生物可利用性）和干扰能量代谢（抑制糖酵解与OXPHOS），使联合暴露的毒性效应远超单一污染物。例如，HFPO-DA+Cd组ATP水平较单独Cd暴露组下降58%，而PFOA+Cd组仅下降39%。
2. **生态风险评估**：草履虫作为浮游生物群落的核心成员，其能量代谢受阻可能引发食物链级联效应。研究显示，HFPO-DA在低浓度（1 μg/L）下即可抑制草履虫运动能力，提示即使替代品PFASs也需纳入生态风险管控。
3. **政策建议**：当前环境标准多基于单一污染物，而PFASs与重金属的协同效应可能被低估。需建立联合暴露风险评估框架，特别关注沿海湿地等PFASs与Cd共污染热点区域。

### 局限与未来方向
1. **机制验证需求**：虽通过转录组关联ATP合成与运动能力，但需通过基因敲除实验（如抑制*cox15*或*dyh1*）验证因果关系。
2. **长期毒性研究**：现有14天暴露周期不足以揭示PFASs与Cd的慢性协同效应，需延长至90天以上。
3. **剂量-效应关系**：当前研究基于环境实际浓度（1 μg/L PFASs，50 μg/L Cd），但需扩展浓度梯度以明确阈值。

### 结论
本研究首次系统揭示PFASs替代品（HFPO-DA）与Cd的协同毒性机制：
1. **HFPO-DA的毒性超过PFOA**：在Cd存在下，HFPO-DA更易破坏膜屏障（通透性增加4.1倍）和氧化磷酸化（线粒体蛋白表达下调达46%）。
2. **能量代谢与运动功能互锁**：ATP耗竭（下降32%）和纤毛相关基因（*dyh1-12*）抑制导致运动能力显著下降（距离减少23.4%）。
3. **转录组网络重构**：联合暴露导致能量代谢（糖酵解、脂肪酸氧化）与运动相关基因（动力蛋白、微管蛋白）表达失衡，形成“膜损伤-氧化应激-能量耗竭-运动抑制”的级联效应。

该研究为PFASs替代品的环境风险评估提供了分子生物学证据，强调需将重金属共暴露纳入政策制定，避免“污染替代”风险。