利用定向分化和转录重编程技术生成hiPSC衍生的脑微血管内皮细胞

　　诱导多能干细胞通过FOXF2/ZIC3重编程生成重组脑微血管内皮细胞（rBMECs），其具有更接近生理的BBB屏障特性及3D神经血管相互作用能力，并可用于阿尔茨海默病突变APP V717I的致病机制研究。

　　
### 研究背景与问题
血脑屏障（BBB）作为中枢神经系统（CNS）的重要物理屏障，其功能障碍与阿尔茨海默病、中风等多种神经退行性疾病密切相关。然而，现有体外BBB模型存在以下缺陷：一是依赖有限量的原代人脑微血管内皮细胞（HBMECs），后者难以规模化培养且易去分化；二是诱导多能干细胞（iPSCs）分化得到的脑微血管内皮细胞（iBMECs）在转录组和功能上与真实脑内皮细胞存在显著差异，例如其紧密连接蛋白（TJP）表达不足、炎症相关黏附分子（LAMs）异常上调等。因此，亟需开发一种高效、稳定且具有完整脑内皮细胞特征的模型，以推动神经疾病机制研究和靶向药物递送系统的开发。

### 研究方法概述
本研究提出了一种两阶段重编程策略，旨在克服传统iBMECs的局限性：
1. **基础内皮细胞（bpECs）的生成**：通过向iPSCs分化过程中添加BMP4和bFGF等生长因子，诱导生成初步的脑内皮前体细胞（bpECs）。
2. **转录因子介导的重编程**：在bpECs中过表达FOXF2和ZIC3两种转录因子。FOXF2已被证实对维持脑内皮的TJP表达和减少跨细胞运输至关重要，而ZIC3则参与调控脑内皮的发育成熟。通过病毒转染技术将这两种因子高效递送至bpECs，并利用流式细胞术筛选出高纯度的重组脑微血管内皮细胞（rBMECs）。

### 关键发现与结果分析
#### 1. **rBMECs的分子特征**
- **转录组分析**：与HBMECs相比，rBMECs显著上调了多个BBB特异性基因（如CLDN-5、OCLN、ABCC4等），并表达了更高的脑内皮标志物（如FOXF2、ZIC3、SPOCK2等）。
- **蛋白质表达验证**：通过Western blot和免疫荧光染色发现，rBMECs的TJP（如OCLN、CLDN-5）和转运蛋白（如ABCC4）水平显著高于HBMECs和传统iBMECs，同时 caveolar介导的转胞运输量显著降低，表明其屏障功能增强。

#### 2. **功能特性验证**
- **电生理屏障（TEER）**：rBMECs的TEER（平均40.5 ?·cm2）显著高于HBMECs（24.7 ?·cm2）和基础内皮细胞（bpECs，25.0 ?·cm2），且在3D微流体系统中与 astrocytes和pericytes共培养后，其屏障功能进一步强化。
- **透漏率测试**：使用不同分子量染料（376 Da、3 kDa、70 kDa）检测发现，rBMECs的跨细胞屏障（transcytosis）和跨膜屏障（paracellular）均优于传统模型。特别是70 kDa染料的泄漏率极低，证实了其高效屏障特性。
- **炎症与信号通路**：APP V717I突变体rBMECs显示更强的炎症反应（如VCAM-1、ICAM-1表达上调）和屏障功能障碍（TEER降低30%），而外源性β淀粉样蛋白寡聚体（oAβ42）仅激活炎症通路但不影响屏障结构，表明APP突变通过独立机制破坏BBB。

#### 3. **3D微流体NVU系统的构建**
- **多细胞共培养**：在MIMETAS微流体平台中，rBMECs与iPSC衍生的astrocytes和pericytes共培养后，形成连续的血管管腔结构，且TJP（如ZO-1）在细胞间接触区域高度表达。
- **动态剪切应力响应**：3D流动环境（剪切应力0-1.4 dyn/cm2）显著上调rBMECs的TJP（如OCLN、CLDN-5）和BBB相关基因（如MFSD2A），验证了其在生理力学刺激下的成熟性。
- **功能验证**：通过荧光标记发现，rBMECs共培养体系中的中胶层（ECM）中染料泄漏率较单层培养降低50%-60%，表明细胞间相互作用增强了屏障功能。

### 技术创新与优势
1. **双重转录因子调控**：FOXF2和ZIC3的协同作用不仅修复了传统iBMECs的TJP缺陷，还调控了脑特异性基因（如APCDD1、TNFRSF19）的表达，使rBMECs在分子层次上更接近真实脑内皮细胞。
2. **动态微流体系统**：通过MIMETAS平台模拟体内血流动力学，结合多细胞共培养（ECs-astrocytes-pericytes），成功构建了具有类器官特征的神经血管单元（NVU），其TEER值和低泄漏率接近临床前模型。
3. **疾病模型适用性**：APP V717I突变体rBMECs可独立于β淀粉样蛋白沉积，显示屏障功能障碍和促炎表型，为阿尔茨海默病早期病理研究提供了工具。

### 应用潜力与未来方向
1. **药物递送系统开发**：rBMECs的高效转运蛋白（如ABCC4）和紧密连接结构，可优化纳米载体或小分子药物穿过BBB的效率。
2. **神经退行性疾病机制研究**：通过监测APP突变rBMECs与神经元共培养时的炎症因子变化（如TNF-α、IL-1β），可解析β淀粉样蛋白病理级联反应。
3. **个性化治疗模型**：利用患者来源的iPSCs生成rBMECs，结合基因编辑（如APP V717I过表达），可建立个体化疾病模型以测试靶向治疗策略。

### 局限性及改进空间
1. **基因表达不完全**：rBMECs的MFSD2A（跨细胞运输抑制因子）表达水平仍低于天然脑内皮细胞，需进一步优化转录因子组合或联合小分子干预。
2. **批次依赖性**：商业HBMECs批次间的功能差异可能影响结果可比性，建议长期合作中标准化样本来源。
3. **成熟度限制**：rBMECs的转录组更接近胎儿脑内皮细胞，未来可通过添加成熟因子（如Wnt/β-catenin抑制剂）或与成体细胞共培养模拟更复杂的微环境。

### 总结
本研究通过联合转录因子重编程和3D动态微流体培养，成功构建了具有接近天然脑内皮细胞分子和功能特性的rBMECs模型。该模型在疾病研究（如阿尔茨海默病APP突变效应）和药物开发（如BBB穿透剂优化）中展现出巨大潜力，为建立更真实的神经血管单元提供了新范式。未来需进一步整合多组学数据（如单细胞测序）和临床样本验证，以完善其临床转化价值。