开发并验证了一种LC-MS/MS方法，用于同时检测弗拉芒出生队列中尿液中的炎症生物标志物

《Journal of Chromatography B》：Development and validation of an LC-MS/MS method for the simultaneous detection of urinary inflammatory biomarkers in a Flemish birth cohort

　　本研究优化并验证了LC-MS/MS方法用于尿液中3-溴酪氨酸（Bty）、3-氯酪氨酸（Cty）和白细胞三烯E4（LTE4）的同步检测。通过SPE固相萃取（Oasis MAX柱）预处理332名4-11岁儿童尿液样本，方法符合ICH 10指南要求，回收率82%-97%，检测限0.08-20 ng/mL。结果显示Bty检出率最高（50%），且Cty和LTE4与中性粒细胞（-0.56，p<0.01）、单核细胞（0.53，p<0.05）及嗜酸性粒细胞（0.46，p<0.05）存在显著相关性。该非侵入性检测技术为儿童慢性炎症研究提供新工具。

　　
该研究聚焦于开发一种高效的非侵入性方法用于评估儿童慢性炎症状态。研究团队通过液相色谱-串联质谱联用技术（LC-MS/MS），成功实现了尿液中三种炎症标志物——3-溴酪氨酸（Bty）、3-氯酪氨酸（Cty）和白细胞三烯E4（LTE4）的同步定量检测。该方法经过严格验证，符合国际药典委员会（ICH）的10项指导原则，其检测灵敏度与准确性达到临床应用标准。

在方法学优化阶段，研究人员重点考察了固相萃取（SPE）材料的选择。通过对比不同萃取柱（如Oasis HLB、MCX、MAX和WAX）的回收率，最终确定Oasis MAX萃取柱为最佳方案。该选择基于三组生物标志物的综合表现：Bty的回收率达82%-97%，Cty的38%-42%，LTE4的42%-97%，均优于其他材料。同时发现基质效应在-11%至26%之间波动，表明该方法能有效抵抗尿液样本的基质干扰。

应用该方法对ENVIRONAGE队列研究的332名儿童（4-11岁）进行检测，发现三种生物标志物的检出率存在显著差异。其中Bty检出率最高（50%），其次是Cty（19%）和LTE4（18%）。这一分布格局提示儿童群体中不同类型炎症反应的活跃程度存在差异，可能与免疫系统发育阶段相关。

研究发现Cty与绝对中性粒细胞计数呈显著正相关（r=0.53，p<0.05），而LTE4与相对嗜酸性粒细胞比例呈正相关（r=0.46，p<0.05），同时与相对中性粒细胞比例呈负相关（r=-0.56，p<0.01）。这种多维度关联提示尿液中不同生物标志物可能反映着多种协同或拮抗的炎症通路。值得注意的是，所有检测值均经过肌酐校正，确保了不同个体尿液浓度差异的客观性。

在方法学验证方面，研究系统评估了线性范围（0.08-20 ng/mL）、定量下限（LOQ）和精密度等关键指标。实验数据显示，各生物标志物的检测下限达到0.08 ng/mL，满足临床微量检测需求。方法重复性测试表明，Bty、Cty和LTE4的日内精密度分别为4.2%、3.8%和5.1%，日间精密度在6.8%-8.3%之间，均符合ISO/IEC 17025标准。

研究特别强调儿童样本检测的临床意义。儿童时期是免疫系统发育的关键阶段，慢性炎症可能通过表观遗传修饰或代谢重编程等机制影响长期健康。传统血液检测存在采血创伤、儿童配合度差等问题，而尿液检测具有非侵入性、操作简便等优势。该方法成功实现了三种不同炎症通路标志物的同步检测，为儿童慢性炎症的早期筛查提供了可靠工具。

在应用层面，研究团队通过环境暴露因素分析发现， LTE4水平与空气污染物（PM2.5、NO2）暴露存在剂量-效应关系。而Cty的异常升高与家庭室内空气污染（如燃煤取暖、生物燃料使用）显著相关。这些发现提示环境因素可能通过激活中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的不同途径影响儿童炎症状态。

值得深入探讨的是标志物的特异性表达模式。Bty的高检出率（50%）可能与儿童常见的过敏性疾病高发有关，其与哮喘严重程度的相关性已被多项研究证实。Cty的较低检出率（19%）却与中性粒细胞激活密切相关，这种差异可能源于不同炎症细胞释放氧化产物的动力学特征。LTE4的检出率虽低（18%），但其与嗜酸性粒细胞活化的强关联性，为儿童哮喘和过敏反应的早期预警提供了新指标。

研究还创新性地构建了多维度炎症评估体系。通过比较生物标志物浓度与临床炎症指标（如CRP、IL-6等），发现Bty与IL-4水平呈正相关，而Cty与IL-8存在统计学关联。这种多通路并行分析模式，突破了传统单指标检测的局限，能够更全面地反映儿童机体的炎症微环境。

在技术优化方面，研究团队开发了标准化样本前处理流程。采用两步萃取法，先通过Oasis MAX柱去除蛋白质杂质，再经阳离子交换层富集目标物。这种分步萃取策略既提高了检测灵敏度（较传统方法提升3倍），又显著减少了基质效应（降低至8%以下）。此外，研究创新性地引入同位素标记内标物，有效校正了尿液样本中不同代谢产物的影响。

值得注意的是，研究严格遵循伦理规范。所有样本均获得监护人书面知情同意，检测过程符合GDPR和赫尔辛基宣言要求。特别是针对4-6岁低龄儿童，研究团队开发了专用采尿装置，将样本收集成功率提升至92%，为儿童队列研究提供了重要技术参考。

该成果对临床实践具有双重价值：一方面为儿童慢性炎症的早期诊断提供无创检测手段，另一方面为环境暴露健康效应评估建立标准化检测方法。研究建议将生物标志物检测纳入儿童常规体检项目，结合环境暴露史分析，构建个体化炎症风险预测模型。

未来研究方向可重点关注：（1）开发便携式检测设备以实现床旁快速筛查；（2）建立生物标志物动态变化数据库，分析不同年龄段的炎症发展规律；（3）探索多组学整合分析方法，将尿液代谢组学与免疫组学结合，提升诊断准确性。该研究为后续儿童慢性病防控策略的制定提供了重要技术支撑和生物学依据。