基于部分逆转GABA支流的代谢工程改造：大肠杆菌利用葡萄糖生物合成γ-氨基丁酸的新策略

《Applied Biochemistry and Microbiology》：Metabolic Engineering of Escherichia coli for Biosynthesis of Gamma-Aminobutyric Acid from Glucose Resulting from a Partial Reversal of GABA-Shunt Mediated by the Action of 2-Ketoglutarate Decarboxylase

　　本研究针对传统γ-氨基丁酸（GABA）生物合成途径依赖谷氨酸底物的局限性，通过代谢工程手段重构大肠杆菌代谢网络，首次实现了通过部分逆转GABA支流从葡萄糖直接合成GABA。研究人员通过表达结核分枝杆菌2-酮戊二酸脱羧酶（KGD）基因，阻断琥珀酸半醛脱氢酶（SSADH）活性，并增强4-氨基丁酸转氨酶（GABT）表达，使GABA摩尔产率从11%提升至25%，为GABA绿色制造提供了新范式。

　　

在生物医学和工业领域，γ-氨基丁酸（GABA）作为一种重要的四碳非蛋白质氨基酸，不仅在中枢神经系统中扮演着抑制性神经递质的角色，对失眠、阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病具有潜在治疗价值，还是合成生物可降解聚酰胺尼龙4的关键前体。然而，传统GABA生产主要依赖化学合成或谷氨酸脱羧酶（GAD）催化的生物转化法，这些方法存在原料成本高、工艺复杂等局限性。

面对这些挑战，俄罗斯科学院生物技术基础研究中心的Skorokhodova等研究人员在《Applied Biochemistry and Microbiology》发表创新性研究，通过精巧的代谢工程设计，在大肠杆菌中构建了一条全新的GABA合成途径。该研究突破传统GABA支流（GABA-shunt）的正向代谢模式，首次实现通过部分功能逆转该途径，使微生物能够直接从廉价葡萄糖高效合成GABA。

研究团队以先前构建的琥珀酸生产菌株SUC1.0为底盘细胞，该菌株已具备修饰后的葡萄糖转运磷酸化系统，缺失混合酸发酵途径、乙醛酸支流和琥珀酸好氧转化能力。通过引入结核分枝杆菌来源的2-酮戊二酸脱羧酶（KGD）基因，研究人员成功将代谢流从2-酮戊二酸导向琥珀酸半醛（SSA）的形成。为阻止SSA进一步氧化为琥珀酸，他们系统性地敲除了NAD+-依赖性（sad基因）和NADP+-依赖性（gabD基因）琥珀酸半醛脱氢酶。同时，为促进SSA向GABA的转化，研究人员还敲除了谷氨酸脱羧酶A和B（gadA/gadB）以避免GABA降解，并通过引入λ噬菌体PL启动子和T7噬菌体φ10基因核糖体结合位点强化了4-氨基丁酸转氨酶（gabT基因）的表达。

关键技术方法包括：利用λ-Red同源重组系统进行基因敲除和表达调控元件替换；通过P1转导技术转移遗传修饰；使用温度敏感型质粒pMWts-Int/Xis进行标记基因切除；采用HPLC和GC-MS分别对有机酸和GABA进行定量分析。

菌株构建与代谢重构

研究人员通过逐步代谢工程改造，构建了四个衍生菌株。GABA1.0菌株仅敲除sad基因后，琥珀酸产量仍维持较高水平（56.6%），表明NADP+-依赖性SSADH（GabD）仍能有效催化SSA转化。GABA2.0菌株进一步敲除gabD基因后，琥珀酸产量急剧下降至20.6%，同时葡萄糖消耗量显著减少，表明SSA在细胞内积累产生毒性效应。GABA3.0菌株额外敲除gadA/gadB基因后，在KGD表达诱导下GABA产率达到10.6%，证实通过部分逆转GABA支流合成GABA的可行性。最终GABA4.0菌株通过强化gabT表达，使GABA摩尔产率提升至24.7%，显著高于基础菌株通过“谷氨酸溢流”效应产生的7.5%。

代谢特性分析

实验数据显示，核心菌株SUC1.0(pMW119-kgd)在未诱导KGD表达时，主要通过天然TCA循环合成琥珀酸（产率23.8%），同时通过谷氨酸脱羧酶作用产生少量GABA（7.5%）。诱导KGD表达后，琥珀酸产率升至62.8%，但GABA检测不到，表明碳流完全导向琥珀酸合成。随着代谢工程的逐步优化，GABA4.0(pMW119-kgd)在KGD表达诱导下，GABA产率（24.7%）首次超过琥珀酸（21.1%），证明部分逆转GABA支流策略的有效性。

讨论与展望

本研究通过代谢工程手段成功实现了GABA合成路径的创新性重构。研究人员指出，细胞内SSA和L-谷氨酸的平衡对GABA高效合成至关重要。2-酮戊二酸既可作为KGD的底物生成SSA，也可通过谷氨酸脱氢酶/合酶转化为L-谷氨酸，两者间的碳流分配直接影响GABA合成效率。此外，4-氨基丁酸转氨酶活性不足原本是限制SSA转化为GABA的关键因素，通过表达强化成功解决了这一瓶颈。

该研究的重要意义在于开辟了不依赖谷氨酸底物的GABA生物合成新途径，为微生物细胞工厂的精准设计提供了范式。尽管25%的摩尔产率尚未达到理论最大值，但研究证明了通过优化前体供应和酶活性平衡，完全有可能实现GABA作为葡萄糖转化主要产物的目标。这种基于部分逆转代谢支流的策略，不仅适用于GABA生产，也为其他高值化学品的生物制造提供了新思路。

研究最后强调，通过系统优化2-酮戊二酸向SSA和L-谷氨酸的转化平衡，进一步完善该合成途径，有望使GABA成为工程化大肠杆菌利用葡萄糖的主要发酵产品，为GABA的绿色生物制造奠定坚实基础。