工程化恶臭假单胞菌分泌纤维素酶实现纤维素寡糖生长

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Cellulase secretion by engineered Pseudomonas putida enables growth on cellulose oligomers

　　本研究针对恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）无法天然降解纤维素的瓶颈，通过工程化改造使其分泌外切纤维素酶（CelK）和内切纤维素酶（CelA），利用Tat/Sec分泌信号肽实现酶的高效胞外释放。结果表明，改造菌株可在纤维素寡糖（如纤维三糖、纤维四糖）为唯一碳源时生长，为开发低成本木质纤维素生物炼制中的单步糖化-发酵（CBP）工艺提供了新策略。

　　

随着全球对可持续生物制造需求的日益增长，利用微生物将低价值生物质转化为高附加值化学品已成为研究热点。木质纤维素作为地球上最丰富的可再生资源，其高效转化是降低生物工艺成本的关键。然而，当前生物精炼过程通常需要多步处理：先通过化学或酶法预处理将木质纤维素解聚为可发酵糖，再由微生物发酵生产目标产物。这种多步工艺不仅增加了设备和操作成本，预处理过程中产生的抑制剂（如木质素衍生物）还会对发酵微生物产生毒性。因此，开发能够直接利用原始生物质原料的微生物细胞工厂，实现所谓的“统合生物加工”（Consolidated Bioprocessing, CBP），是领域内追求的理想目标。

在众多候选微生物中，恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）因其卓越的逆境耐受性（尤其对有机溶剂和木质素衍生芳香化合物）和灵活的代谢能力，被视为极具潜力的合成生物学平台菌株。然而，P. putida有一个关键短板：它缺乏天然的纤维素降解能力，无法分泌纤维素酶来水解纤维素这种主要的植物细胞壁多糖。虽然此前研究尝试通过“表面展示”技术将纤维素酶锚定在细胞表面，但这种方法可能限制酶的有效浓度，并无法实现酶在发酵液中的自由扩散，从而影响水解效率。如何让P. putida这类革兰氏阴性菌高效地将大型、复杂结构的功能酶分泌到胞外培养基中，是一个巨大的技术挑战，因为这需要蛋白质成功穿越内膜和外膜两道屏障。

为了解决这一问题，由Madeline R. Smith等人组成的研究团队在《Applied Microbiology and Biotechnology》上发表了一项重要研究。他们成功地对P. putida进行了代谢工程改造，使其能够分泌具有活性的纤维素酶，并首次证明工程菌可以利用纤维素寡糖作为唯一碳源生长。这项工作为开发基于P. putida的CBP工艺奠定了坚实的基础。

本研究采用了几项关键的技术方法：首先，利用合成生物学手段，将来自嗜热厌氧菌（Acetivibrio thermocellus）的外切纤维素酶CelK和内切纤维素酶CelA的基因，与预测来源于P. putida自身胞外蛋白的Sec途径和Tat途径信号肽进行融合，构建了多种分泌表达载体。其次，通过蛋白组学（靶向质谱）定性确认了CelK和CelA在胞外培养基中的存在。再者，使用多种探针底物（如羧甲基纤维素、4-甲基伞形酮-β-纤维二糖苷、对硝基苯-β-纤维二糖苷）定量评估了胞外纤维素酶的活性。最后，在微孔板培养体系中，监测了工程菌株以葡萄糖、纤维三糖或纤维四糖为唯一碳源时的生长曲线，从而验证其利用纤维素寡糖的能力。

分泌活性纤维素酶的恶臭假单胞菌工程设计

研究人员从文献中筛选了两种Tat途径和两种Sec途径的信号肽，这些信号肽已知与P. putida的胞外蛋白相关。他们选用了来自Acetivibrio thermocellus的CelA（内切纤维素酶）和CelK（外切纤维素酶）作为模型酶。通过将酶基因的天然信号肽替换为P. putida的信号肽，并利用XylS/Pm诱导型表达系统，构建了双顺反子表达质粒（pSEC_cellulase和pTAT_cellulase）。为了优化两种酶的表达比例，他们使用计算工具设定了不同的翻译起始速率（TIR），赋予CelK（外切酶）更高的表达水平（TIR ~10,000），而CelA（内切酶）表达水平较低（TIR ~1,000），这模拟了高效水解纤维素聚合物所需的最佳酶比例。

恶臭假单胞菌分泌活性纤维素酶

初步功能验证在固体培养基上进行。将工程菌株点种在含有羧甲基纤维素（CMC）的琼脂平板上，通过刚果红染色后，表达纤维素酶的菌落周围出现了透明圈，表明CMC被水解，而对照菌株则无此现象。这一结果在P. putida KT2440和S12两个菌株背景中均得到证实。为了定量评估酶活，研究人员收集了液体培养物的上清液，并与三种不同的底物反应。结果表明，含有pTAT_cellulase和pSEC_cellulase质粒的菌株上清液均能水解CMC、4-MU cellobioside和p-NP cellobioside，且pTAT_cellulase菌株的酶活性在所有检测中均显著更高。靶向蛋白质组学分析进一步确认了CelK和CelA在培养上清中的存在，同时发现CelK在细胞内也有检出，提示其分泌效率可能存在优化空间。

为了深入探究不同信号肽和表达水平的影响，研究团队构建了系列质粒，分别单独表达带有不同信号肽和TIR的CelA或CelK。实验发现，CelA单独表达时即可水解CMC，提高其TIR能增强水解效果；而只有CelK能够水解4-MU cellobioside和p-NP cellobioside这类针对外切纤维素酶活性的底物。这些数据表明，所选的Tat信号肽（特别是UxpB）在介导这些大分子量、多结构域纤维素酶的分泌方面表现更优。

恶臭假单胞菌在纤维素寡糖上的生长

为了实现纤维素寡糖的完全利用，研究人员构建了一株能够组成型表达胞内β-葡萄糖苷酶（BglC, 来自Thermobifida fusca）的P. putida KT2440基础菌株（PEM7-cbh）。该酶可将水解产物纤维二糖在胞内进一步分解为葡萄糖。将纤维素酶分泌质粒转入该菌株后，评估其在纤维三糖上的生长情况。结果显示，在未诱导（背景表达）条件下，携带pTAT_cellulase质粒的工程菌（pTAT_cellulase PEM7-cbh）在纤维三糖上表现出最明显的生长。诱导表达反而抑制了生长，这可能是因为过量表达和分泌异源蛋白造成了细胞负担。

随后，研究人员详细比较了pTAT_cellulase PEM7-cbh菌株与对照菌株在不同碳源上的生长性能。在葡萄糖上，工程菌的生长速率（0.31 h^-1）与对照（0.34 h^-1）相近，表明纤维素酶的表达和分泌在富碳条件下对细胞生长影响不大。然而，当以纤维三糖或纤维四糖为唯一碳源时，工程菌虽然能够生长，但表现出显著延长的滞后期（分别约113小时和145小时）和极低的比生长速率（约0.01 h^-1），最终生物量也较低。值得注意的是，工程菌未能在大分子结晶纤维素（如微晶纤维素Avicel）或再生无定形纤维素（RAC）上生长，表明当前分泌的纤维素酶活性尚不足以解聚聚合度更高的天然纤维素底物。

结论与意义

本研究成功地实现了活性纤维素酶在恶臭假单胞菌中的胞外分泌，并证明其酶活性足以支持菌株以纤维三糖和纤维四糖等纤维素寡糖作为唯一碳源生长。这是P. putida工程化领域的一个重要进展，扩展了该菌株可利用的碳源范围。研究确定了Tat分泌途径的信号肽（特别是UxpB）在介导大分子纤维素酶分泌方面的优势，为后续优化提供了方向。

然而，工程菌在寡糖上缓慢的生长速率和极长的滞后期表明，当前水平的胞外纤维素酶活性仍然是限制其应用于CBP的主要瓶颈。这很可能与革兰氏阴性菌复杂的分泌系统易于饱和，以及异源大分子蛋白的折叠和转运效率有关。作者在讨论中指出，通过适应性实验室进化（Adaptive Laboratory Evolution）或进一步工程化改造分泌系统组件（如上调Tat复合物或膜应激蛋白表达），有望突破这一限制。

总之，这项研究为开发能够直接利用廉价、未处理的木质纤维素原料的P. putida细胞工厂迈出了关键一步。它不仅展示了合成生物学工具在重构微生物代谢能力方面的强大潜力，也为降低生物炼制过程的成本和复杂性提供了新的思路。未来，通过持续优化分泌效率和酶活性，并结合P. putida对其他生物质衍生糖（如木糖、阿拉伯糖）的共利用能力，有望构建出更高效、更经济的下一代生物制造平台。