铁稳态失衡与隐窝克隆性扩增驱动衰老相关肠道DNA甲基化漂移并促进肿瘤发生

《Nature Aging》：Iron homeostasis and cell clonality drive cancer-associated intestinal DNA methylation drift in aging

　　本研究针对衰老与结直肠癌中表观遗传漂移的起源机制这一关键科学问题，通过多组学分析揭示了肠道干细胞中年龄相关的铁代谢紊乱通过抑制TET酶活性，驱动特定基因启动子区DNA高甲基化（ACCA漂移），并经由隐窝克隆性扩张在衰老肠道中传播。该发现阐明了衰老相关表观遗传改变如何作为癌症发生的“种子”，为理解年龄相关疾病提供了新机制见解。

　　

随着年龄的增长，生物体会经历一系列复杂的生理变化，其中表观遗传修饰的改变尤为显著。表观遗传漂移（epigenetic drift）作为衰老的一个重要特征，与多种年龄相关疾病（包括癌症）的发生发展密切相关。然而，这种随年龄增长而逐渐积累的表观遗传改变的分子机制至今仍未完全阐明。在结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）中，异常DNA甲基化（DNA methylation, DNAm）模式，如CpG岛甲基化表型（CIMP），是常见的表观遗传改变，但其在衰老过程中的起源和驱动因素尚不清楚。发表在《Nature Aging》上的这项研究，题为“Iron homeostasis and cell clonality drive cancer-associated intestinal DNA methylation drift in aging”，通过整合分析人类和小鼠肠道样本的多组学数据，揭示了衰老相关肠道DNA甲基化漂移（命名为ACCA漂移）的细胞起源、分子机制及其在肿瘤发生中的潜在作用。

为了深入探究这一科学问题，研究人员运用了多种关键技术。他们分析了来自癌症基因组图谱（TCGA）的人类结肠样本全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）和基因表达数据，并利用小鼠模型（包括Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2小鼠用于肠道干细胞分选，Rosa26-lsl-Confetti小鼠用于克隆追踪）进行功能验证。关键技术包括：全基因组/简化代表性亚硫酸氢盐测序（WGBS/RRBS）用于全基因组DNA甲基化图谱分析；激光捕获显微切割（LCM）结合单隐窝亚硫酸氢盐焦磷酸测序用于空间分辨的DNA甲基化分析；肠道类器官（Organoid）体外培养体系用于机制研究（如使用铁螯剂、TET酶抑制剂C35、CHIR99021等处理）；染色质免疫沉淀（ChIP）、hMeDIP（5hmC富集）、酶活性检测（TET/DNMT）以及RNA测序（RNA-seq）等分子生物学技术；此外，还利用了生物信息学方法进行主成分分析（PCA）、基因富集分析（GO）和相关性分析等。

研究结果

Fig. 1 | 结肠癌与表观遗传漂移细胞相关

研究人员首先通过分析TCGA数据库中人类健康与结肠癌样本的WGBS数据发现，主成分分析（PCA）能很好地将健康与癌变样本分开，并且健康样本的DNA甲基化模式与年龄相关。他们鉴定出一组在衰老和结肠癌中均发生高甲基化的基因启动子，将其定义为衰老和结肠癌相关表观遗传漂移（ACCA drift）。这些基因富集于细胞内信号传导（如cAMP信号）和干细胞相关通路（如Wnt信号）。值得注意的是，ACCA漂移在所有的结直肠癌中均有显现，而不仅限于CIMP阳性肿瘤。

Fig. 2 | ACCA漂移在小鼠肠道中保守，起源于干细胞水平且独立于细胞周期

研究证实ACCA漂移在小鼠肠道中同样存在。通过分离年轻和年老小鼠的肠道隐窝和Lgr5^hi肠道干细胞（ISCs）进行RRBS和WGBS分析，发现DNA高甲基化（特别是在CpG岛和基因启动子区）起始于肠道干细胞层面，并且能在整个隐窝中维持。利用类器官模型，研究人员发现即使降低培养体系中的生长因子浓度（如ENR 50%, ENR 25%）以减缓细胞增殖，ACCA漂移并未减弱反而有所增强，表明这种漂移并非由细胞分裂驱动。相反，通过添加CHIR99021（GSK3β抑制剂）或重组Wnt3a蛋白激活Wnt通路，则能降低ACCA漂移相关基因的甲基化水平，提示Wnt信号通路在调节DNA甲基化漂移中扮演重要角色。

Fig. 3 | DNA甲基化漂移在CpG水平具有异质性，但在基因启动子水平一致

通过对单个肠道隐窝进行DNA甲基化分析，研究人员发现年老小鼠的隐窝呈现出三峰分布的甲基化模式（完全未甲基化、约50%单等位基因甲基化、100%双等位基因甲基化），这反映了单个干细胞（隐窝的起源细胞）的甲基化状态。尽管在单个CpG位点水平存在异质性，但在整个基因启动子水平，甲基化变化是一致的。多个基因的分析显示，在年老的隐窝中，这些基因的甲基化存在正相关，表明存在具有增强型DNA甲基化漂移的隐窝亚群。

Fig. 4 | DNA甲基化漂移通过隐窝分裂进行扩增

研究进一步探索了ACCA漂移的传播机制。通过对相邻隐窝的DNA甲基化谱进行分析，发现相邻隐窝之间存在高度相似的甲基化模式。利用Confetti报告小鼠模型进行谱系追踪，发现在体内衰老过程中，具有相同颜色（即相同克隆起源）的隐窝更倾向于形成簇状分布，并且这些簇内的隐窝在ACCA漂移基因（如Dkk2）上表现出更高的甲基化水平和更强的甲基化模式相关性。这些结果强有力地表明，表观遗传漂移的细胞通过隐窝分裂（crypt fission）机制进行克隆性扩增，并在衰老肠道中形成表观遗传漂移的“斑块”。

Fig. 5 | 表观遗传漂移的隐窝铁代谢失衡

为了阐明ACCA漂移的起源机制，研究人员对高甲基化和低甲基化的单隐窝进行了转录组（RNA-seq）分析。结果显示，高5mC隐窝的转录谱与低5mC隐窝显著分离，并且铁稳态相关通路显著富集。具体而言，在高5mC隐窝和年老小鼠的隐窝中，铁转运蛋白（转铁蛋白受体TfR1）表达下调，而铁输出蛋白（铁转运蛋白FPN1）表达上调，导致细胞内Fe²⁺水平降低。Fe²⁺是TET双加氧酶的关键辅因子。实验证实，年老隐窝中TET酶（特别是TET2和TET3）的羟甲基化活性显著降低，而DNMT酶活性无差异。ChIP实验证明TET2/TET3结合在Dkk2/Sfrp1等基因的启动子区，其5hmC水平在年老隐窝中下降。功能实验表明，在类器官中抑制TET活性（使用C35抑制剂）或敲除Tet2/3基因，会导致Dkk2/Sfrp1启动子高甲基化；同样，使用铁螯合剂（DFO）耗竭细胞内铁也会重现高甲基化表型。

Fig. 6 | 恢复转铁蛋白受体表达或激活Wnt通路可挽救铁稳态

最后，研究人员尝试干预这一过程。在来自年老小鼠的肠道类器官中重新表达Tfrc（转铁蛋白受体基因），能够提高TET酶活性，并降低ACCA漂移基因的甲基化水平。此外，他们发现降低Wnt信号（减少R-spondin）会轻微下调TfR1蛋白水平，并损害铁稳态和TET活性；而添加Wnt3a或CHIR99021则呈现相反效果。当用干扰素γ（IFNγ）处理类器官模拟炎症衰老时，会破坏铁稳态并抑制TET活性，而同时添加Wnt3a则可以挽救这一效应。这表明，衰老相关的炎症应激和Wnt信号减弱是促进铁代谢紊乱和DNA甲基化漂移的驱动因素，而恢复转铁蛋白受体或补充Wnt因子可以挽救铁稳态，从而抵抗DNA甲基化漂移。

结论与意义

本研究系统地鉴定并深入阐释了一种肠道特异性的、与衰老和癌症相关的DNA甲基化漂移（ACCA漂移）。其主要结论是：在衰老过程中，肠道干细胞内由于年龄相关的炎症和Wnt信号减弱，导致铁代谢紊乱（TfR1下调、FPN1上调），细胞内可利用的Fe²⁺减少，进而抑制了以Fe²⁺为辅因子的TET酶（特别是TET2/TET3）的活性。TET酶活性降低使得其靶基因（如DKK、SFRP家族基因）启动子区的主动去甲基化过程受损，从而引发这些位点的DNA高甲基化（ACCA漂移）。这种表观遗传改变起源于单个肠道干细胞，并通过隐窝的克隆性扩张和隐窝分裂机制在衰老的肠道上皮中传播和积累。携带ACCA漂移的隐窝可能具有生存优势，并被正向选择，最终增加了结直肠癌发生的风险。

这项研究的重要意义在于：首先，它将衰老过程中的系统性变化（如炎症）、细胞代谢（铁稳态）、表观遗传调控（TET酶活性）和细胞动力学（隐窝克隆性）有机地联系起来，揭示了衰老相关表观遗传漂移的一种新型细胞内在分子机制。其次，它解释了为什么某些表观遗传改变在衰老组织和癌组织中同时出现，为“表观遗传漂移是癌症发生的早期种子”这一假说提供了直接的实验证据。最后，研究指出了通过干预铁代谢或Wnt信号通路来延缓肠道表观遗传衰老和预防年龄相关性肿瘤的潜在策略，为开发新的衰老干预措施提供了新的思路。