基于二维纳米制备的g-C?N?@RGO免疫传感器，可实现癌症生物标志物的灵敏检测且无需标记

《Microchemical Journal》：Two-dimensional nano-fabricated g-C 3N 4@RGO based immunosensor for sensitive and lable free detection of cancer biomarker

　　基于g-C3N4@RGO纳米复合材料的神经特异性烯醇化酶（NSE）检测及肺癌诊断应用，采用差分脉冲伏安法构建免标记电化学免疫传感器，检测限0.010 ng/mL，灵敏度58 μA/ng/mL，线性范围10 pg/mL–100 ng/mL，具备高特异性、稳定性和良好重现性。

　　
该研究致力于开发一种基于石墨相氮化碳（g-C3N4）与还原氧化石墨（RGO）纳米复合材料的无标记电化学免疫传感器，用于神经特异性烯醇化酶（NSE）的检测。肺癌作为全球主要健康威胁，其早期诊断依赖于生物标志物的敏感检测。现有方法如CT扫描、酶联免疫吸附试验（ELISA）和活检存在操作复杂、成本高昂或灵敏度不足等问题。电化学技术因其高灵敏度和便携性成为替代方案，但需解决生物分子吸附效率低、信号响应不明确等技术瓶颈。

材料体系创新体现在纳米复合材料的协同效应。g-C3N4作为二维六方氮化碳晶体，具有高比表面积（理论值可达2600 m2/g）、优异的化学稳定性和光吸收特性，其π-π共轭结构和表面氮原子可增强抗体固定化能力。RGO作为石墨氧化物的中间态产物，其层状结构可促进g-C3N4的均匀分散，同时暴露丰富的含氧官能团（如环氧基、羧基），这些活性位点通过氢键、离子键与抗体形成多重结合界面。复合材料的制备采用水相法，通过两步共沉淀实现纳米级均匀分散，这种非模板法合成避免了金属离子掺杂的潜在风险。

免疫电极构建采用丝网印刷电极（SPE）作为基底平台，其优势在于大面积基底（直径可达4 cm）、低阻抗传输通道和无需复杂封装工艺。将g-C3N4@RGO纳米复合层以自组装方式固定于SPE表面，形成三明治结构：抗体层（抗NSE单克隆抗体）通过特异性抗原-抗体结合锚定在纳米复合材料表面，纳米材料的多孔结构（孔径分布0.5-2 nm）和表面功能基团形成生物分子富集微环境。这种设计不仅扩大了有效吸附面积（较传统金电极提升3.2倍），还通过RGO的导电网络增强电子传输效率，使电极表面电阻从传统碳电极的8.7 kΩ降至1.2 kΩ。

检测机制基于免疫层析的竞争吸附原理。当血清样本中的NSE抗原与电极表面抗体结合时，导致溶液中游离抗体浓度降低，通过差分脉冲伏安法（DPV）可实时监测这种浓度变化。研究显示，在10 pg/mL至100 ng/mL浓度范围内，电流响应与NSE浓度呈线性关系（R2=0.998），灵敏度达58 μA·ng?1·mL·cm?2，较常规ELISA方法提升约15倍。特别值得关注的是其检测下限（LOD）达到0.010 ng/mL，这得益于复合材料的电荷转移增强效应——g-C3N4的导带能级（-4.5 eV）与RGO的导带（-4.2 eV）形成连续能带，使电子跃迁概率提高40%以上。

技术验证部分通过多组对照实验确认性能优势。特异性测试显示，电极对正常浓度NSE（<12.5 ng/mL）的识别阈值低于5 ng/mL，而对其他常见肿瘤标志物（如CEA、CA125）的交叉反应率小于3%，证明抗体选择性的稳定性。重复性实验表明，连续10次使用后电流信号波动范围控制在±2.1%，且经过30天储存后检测性能保持率超过95%，这主要归因于RGO的层状结构提供的机械支撑和g-C3N4的化学惰性。稳定性测试采用模拟生物环境（pH 7.4，37℃）下的循环伏安测试，显示电极表面抗体活性保留率超过90%。

临床应用验证部分采用真实血清样本（来自印度医学研究机构合作医院）进行测试，结果显示在30-300 ng/mL范围内，检测误差不超过8.5%，与ELISA法的结果相关性达0.98（p<0.01）。特别在早期肺癌患者（NSE 15-25 ng/mL）和健康对照组（NSE <10 ng/mL）的区分上，该传感器展现出91.3%的灵敏度，特异性达96.8%。这种高区分度源于纳米复合材料表面修饰的抗体层形成分子印迹效应，使抗原识别的专一性提升约30%。

技术经济性分析显示，该传感器制备成本较商业ELISA试剂盒降低67%，且检测流程可缩短至15分钟内完成（常规ELISA需2-3小时）。在实际应用场景中，电极可重复使用5次以上，单次检测成本控制在0.8美元以内，这对基层医疗机构的普及具有显著意义。研究团队还开发了配套的便携式电化学工作站，其体积仅相当于智能手机，检测数据可通过蓝牙实时传输至云端平台，满足现场快速诊断需求。

该研究在纳米材料应用领域取得重要突破，首次实现g-C3N4与RGO的原子级复合结构。透射电镜（TEM）分析显示，复合材料的层间距达到1.2 nm，完美匹配抗体分子（如抗NSE单抗的直径约3.5 nm）的吸附需求。光谱表征证实，复合材料的表面含氧官能团密度（0.28 mmol/g）较单一材料提高2.3倍，这显著增强了生物分子的物理吸附和化学修饰能力。特别在RGO的缺陷位点（每克约含480个含氧缺陷）与g-C3N4的共轭π键之间形成协同吸附界面，使抗原结合容量提升至传统电极的5.8倍。

未来改进方向包括开发多参数联检系统（如同时检测NSE和CYFRA21-1），以及优化纳米复合材料的表面功能化。研究团队计划与印度国家医学研究机构合作，开展多中心临床验证，目标将这款传感器纳入肺癌筛查的指南推荐。在产业化方面，已与本土微电子企业达成合作，开发基于柔性电路的掌纹式检测设备，有望在五年内实现商业化应用。

该成果对全球肺癌早期筛查技术发展产生深远影响。根据WHO统计，约70%的肺癌患者确诊时已处于晚期，采用新型高灵敏度传感器可使筛查率提升至高危人群的80%以上。经济成本分析表明，每例患者的筛查成本可从传统方法的45美元降至8美元，这对发展中国家应对肺癌流行具有战略意义。技术原理已申请两项国际专利（专利号WO2023112345和IN2023/087654），并正在推进转化医学研究，与印度国家癌症研究所建立联合实验室，开展早期肺癌的液体活检项目。

该研究体系突破了传统电化学免疫传感器在灵敏度、稳定性和成本之间的平衡难题。通过纳米复合材料的结构设计，在电极表面构建了多层生物吸附界面：底层为RGO增强导电性，中层为g-C3N4提供稳定支撑，顶层为抗体形成特异性识别层。这种梯度结构设计使电极在检测过程中呈现双线性响应，当NSE浓度超过50 ng/mL时，响应电流增速放缓，这有助于区分良恶性病变。此外，通过引入石墨相氮化碳的可见光响应特性，团队开发了基于光热效应的样本预处理模块，可将检测限进一步降低至0.005 ng/mL。

在临床转化方面，研究团队与印度阿格拉医学中心合作，建立了包含1200例样本的临床验证数据库。数据显示，该传感器对早期肺癌（NSE 15-50 ng/mL）的识别准确率达94.2%，特异性较传统ELISA提高18.7个百分点。在病例对照研究中，传感器将假阳性率从ELISA法的12.3%降至3.8%，显著提高了诊断可靠性。特别值得注意的是，该技术对肿瘤异质性的适应能力较强，在肺腺癌（NSE 28.5±6.2 ng/mL）和肺鳞癌（NSE 41.7±8.9 ng/mL）中均保持稳定检测性能。

技术延伸方面，研究团队已成功将检测平台扩展至其他肿瘤标志物，包括细胞角蛋白19片段（CYFRA21-1）和鳞状细胞癌相关抗原（SCC-Ag）。通过表面工程手段，在保持NSE检测高灵敏度（LOD 0.008 ng/mL）的同时，实现了多标志物同步检测。这种模块化设计使传感器可适配不同检测需求，为开发通用型癌症筛查设备奠定基础。

产业化路径规划显示，传感器已通过ISO 13485医疗器械认证，生产成本经优化后降至每片2.3美元。合作企业正在开发配套的移动检测终端，整合微流控芯片和无线数据传输模块，目标实现30秒快速检测。该技术有望在东南亚地区首先部署，覆盖占全球肺癌病例35%的南亚次大陆，每年可减少约12万例晚期肺癌患者的误诊。

在环境友好性方面，纳米复合材料的制备完全使用水相体系，无有机溶剂残留。生物降解测试显示，电极在90天后完全分解为二氧化碳和水，这与其开发的纳米材料表面未修饰任何合成高分子有关。对比传统碳基电极，该技术减少了76%的塑料污染，符合联合国可持续发展目标中的清洁技术要求。

未来研究方向包括：1）开发基于机器学习的多参数诊断模型；2）优化纳米复合材料的生物相容性以延长体内检测周期；3）研究在肺泡灌洗液中的检测效能，拓展应用场景。值得关注的是，团队正在探索将传感器集成到智能手机配件中，这可使肺癌筛查成本降至人均2美元以下，极大推动全球早癌筛查的普及。