种间竞争制约多物种生物膜中假单胞菌生态多样化的新机制

《npj Biofilms and Microbiomes》：Competition between Pseudomonas species constrains ecological diversification in polymicrobial biofilms

　　本研究针对多物种生物膜中长期进化动态不清的问题，通过定制3D打印流动系统开展为期18天的实验，追踪Pseudomonas defluvii (PD) 和 Pseudomonas brenneri (PB) 在复杂群落中的适应性演化。研究发现种间相互作用通过限制PD的表型和基因型多样化（如diguanylate cyclases和chemotaxis基因突变）而稳定其进化轨迹，但对PB影响较小。该成果为临床和工业场景中微生物群落的预测与调控提供了新视角。

　　

在自然界中，微生物很少单独存在，它们更倾向于聚集在一起形成被称为生物膜（Biofilm）的复杂群落。这种生活方式是如此普遍，以至于地球上40-80%的细菌种群都以生物膜的形式存在。生物膜内部如同一个微型的“城市”，存在着营养物质、氧气和细胞外基质成分的梯度分布，这种异质性环境为细菌的多样化进化提供了温床。在单物种生物膜中，这种多样化现象已被广泛研究，然而，当多种微生物共同生活在一个生物膜中时，它们之间的相互作用——是合作还是竞争——将如何影响彼此的进化轨迹？这个问题的答案对于理解微生物在自然环境、人体健康（如慢性感染）和工业生物技术中的作用至关重要。

尽管已有研究探索了包含2-3个物种的简单生物膜中的协同进化，但对于更复杂群落（物种数>3）在较长时间尺度（>7天）上的进化动态，我们仍知之甚少。传统的实验方法，如每日转移生物珠，在模拟成熟、稳定的生物膜环境方面存在局限。因此，迫切需要新的实验模型来填补这一知识空白，揭示复杂微生物群落中长期的适应性演化规律。

发表在《npj Biofilms and Microbiomes》上的这项研究，正是为了回答这一挑战。由哥本哈根大学和匹兹堡大学的研究人员Rocio Espinosa, Isabel-Sophie Kramer, Cristina I. Amador等领导的研究团队，设计了一种创新的3D打印流动模型，成功地对包含多达5个物种的生物膜进行了长达18天的培养和监测。他们重点关注了从污水处理厂分离的两种具有竞争关系的假单胞菌——Pseudomonas defluvii (PD) 和 Pseudomonas brenneri (PB)。研究旨在揭示种间多样性是如何影响这两个物种在成熟生物膜中的表型和基因型变异的。

为了开展这项研究，作者团队运用了几个关键的技术方法：利用定制3D打印流动系统进行长期（18天）生物膜培养；通过16S rRNA基因扩增子测序分析群落组成；利用流式细胞术（FACS）分选和表型筛选（刚果红平板）分析变异频率；采用全群体和全基因组测序（WGS）鉴定突变；并通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察生物膜空间结构。研究所用菌株来源于丹麦的污水处理厂。

结果

一种新颖的实验方法使得研究长期种间相互作用对生物膜遗传多样性的影响成为可能

研究人员开发了定制3D打印生物膜流动模型（图1），该模型可同时容纳两张载玻片，允许对同一生物膜样本进行多种分析（如测序和显微镜观察）。他们将荧光标记的PD和PB与不同组合的其他物种（Bacillus thuringiensis, BT; Brevundimonas diminuta, BD; Pandoraea communis, PC）共同培养，创建了从单物种到五物种的不同复杂度的群落，并在第4、10、14和18天进行采样分析。

P. defluvii 可以在复杂的生物膜中持续存在，尽管丰度较低

物种丰度分析显示（图2b），PB在所有群落和每个采样日均占主导地位（50-96%），尤其是在双物种（PD:PB）生物膜中，其丰度高达96%，表明其对PD存在竞争优势。然而，PD在所有双物种和多物种群落中均能持续共存，尽管其丰度随着群落复杂性的增加而降低（从单物种的2-14%降至多物种的0.3-4%）。其他菌株也表现出不同的持续模式，例如BD的丰度随时间增加，而BT和PC的丰度则下降。

多样性对 P. defluvii 和 P. brenneri 的表型适应产生不同影响

通过高通量表型筛选（基于菌落形态），研究发现PD在单物种生物膜中表现出较高的表型变异（50-70%），但在与其他物种共培养时，变异频率显著下降至0-20%（图3a，棕色）。相反，PB的表型变异在所有条件下都较低（单物种0-7%），且在多物种群落中仅有轻微增加（图3a，蓝色）。PD的变异体表现出明显的皱纹表型和更大的菌落，而PB的变异体仅表现出轻微的颜色差异。

与 P. brenneri 相反，种间相互作用对 P. defluvii 群体的基因型特征具有稳定作用

全基因组测序分析进一步证实了表型观察结果（图3c）。PD在单物种生物膜中突变基因数量最多（9个），而在双物种和多物种组合中突变基因减少（4-5个），但特定突变的频率倾向于增加。这些突变主要涉及三类基因：c-di-GMP代谢/生物膜代谢、膜蛋白/通用信号转导以及趋化性（Chemotaxis）。相反，PB的基因型变异较少，且在双物种组合中突变更为频繁。对单个克隆的测序将PD的皱纹表型与双鸟苷酸环化酶（Diguanylate Cyclase, DGC）的突变联系起来，而其他表型则与趋化蛋白（如Aer4, Aer5, CheA, CheB3, CheY）的突变相关。

生物膜结构揭示了竞争菌株之间的混合而非种间隔离

共聚焦显微镜图像显示（图4），PD和PB在所有组合中均呈现随机混合的空间分布，并未因额外物种的加入而发生显著改变。这种混合模式在实验后期（第18天）似乎更为明显。 pairwise cross-correlation (PCC) 分析表明，在更复杂的群落（四、五物种）中，两者的空间定位更趋稳定。

进化变异体促进了 P. defluvii 与 P. brenneri 的共存

为了验证进化变异体的适应性优势，研究人员将分离出的PD变异体与PB祖先菌株或PB变异体进行为期10天的共培养实验。结果表明（图5a），与祖先组合相比，PD变异体与PB祖先菌株共培养时，其丰度平均增加了6倍。显微镜图像也证实了PD变异体在生物膜中与PB共存的能力增强（图5c）。这表明在生物膜和趋化性相关基因中发生的突变，为PD变异体提供了与PB更好共存的适应能力。

0.05), except for PD.V2(p= 0.0195) and PD.V5(p= 0.0101). B

765 CFU/slide of all bacteria grown in each combination shown over time, representing biofilm 766 formed on the PC slide. Data represents the mean(n= 3) and SEM, with three technical 767 replicates each. CFU counts showed no significant difference between any combination for 768 either strain(Tukey's post-hoc test; p>0.05). C CLSM images from some of the different dual 769 combinations on day 10 of the experiment. P. defluvii and its derived variant(PD.V2) are shown 770 in green, whereas P. brenneri and its derived variant(PB.V2) are shown in red. The images 771 were taken with a 63x oil objective. The chosen images are representative of three biological 772 replicates, recorded with at least six positions. The scale bar represents 20μm.'>

结论与讨论

本研究通过创新的3D打印流动模型，首次在复杂（最多五物种）且稳定建立的生物膜中，长达18天的时间内追踪了两个竞争性假单胞菌的进化轨迹。研究得出结论：种间相互作用以物种特异性的方式影响适应性进化。对于处于竞争劣势的P. defluvii，种间多样性通过限制其表型和基因型多样化（即用种间多样性替代了种内多样性）来约束其进化，但同时筛选出了能够更好与P. brenneri共存的“群落优化”变异体，这些变异体的突变集中于c-di-GMP代谢和趋化性相关基因，可能通过增强生物膜形成能力和优化空间定位来实现共存。而对于占优势的P. brenneri，种间相互作用对其进化影响较小，其有限的多样化可能与其主导地位导致的选择压力较小有关。

这项研究的重要意义在于它深化了我们对复杂微生物群落中进化动力学的理解。它表明，生物膜中的进化轨迹不能简单地根据物种的系统发育亲缘关系来预测，竞争相互作用既可以驱动也可以限制适应，这取决于物种在群落中的生态位。研究结果对预测临床（如慢性感染生物膜）和工业（如生物修复、生物制造）环境中微生物群落的建立和持久性具有重要启示。此外，本研究建立的实验方法为未来研究更复杂群落的协同进化提供了强大的工具。最终，这些发现强调了在预测生物膜进化时考虑物种特异性相互作用的必要性，并为进一步探索合作而非竞争相互作用如何塑造进化轨迹奠定了基础。