精神分裂症风险基因RERE的时空动态调控：多组学与单细胞测序的洞见

《Schizophrenia》：Spatiotemporal dynamics of RERE in schizophrenia pathogenesis: insights from multi-omics and single-cell sequencing

　　本研究针对精神分裂症（SCZ）遗传异质性强、致病基因功能不清等难题，整合欧洲与东亚人群GWAS数据，结合多组学与单细胞测序技术，系统解析了RERE基因在SCZ发病中的时空动态调控机制。研究发现RERE通过调控突触相关基因（如PPP4R3B、RPS27L）影响神经元兴奋/抑制平衡，且GABA能神经元是潜在治疗新靶点。该研究为SCZ的精准干预提供了新靶点与理论依据。

　　

精神分裂症（Schizophrenia, SCZ）是一种严重的神经发育障碍，全球约有2400万人受其影响。患者常伴随显著的认知功能损害和社会功能衰退，每年给社会带来数千亿美元的经济负担。目前的治疗策略主要依赖抗精神病药物，但约30%的患者对常规药物治疗无反应，且现有药物难以逆转潜在的神经发育缺陷。因此，深入理解SCZ的遗传发病机制具有重要的临床价值，可为开发新的治疗策略提供理论依据。

基因组关联研究（Genome-Wide Association Study, GWAS）在揭示SCZ遗传基础方面取得了显著进展，但跨人群遗传异质性仍未完全解决。以往研究发现，不同人群（如欧洲和东亚人群）之间存在共享的SCZ遗传风险位点，但其效应大小存在差异。基于欧洲人群GWAS数据构建的多基因风险评分（Polygenic Risk Score, PRS）在东亚人群中的预测效能显著降低。这些差异可能反映了等位基因频率和连锁不平衡（Linkage Disequilibrium, LD）结构的群体特异性。同时，神经发育假说认为，突触修剪异常和GABA能神经元功能障碍是SCZ的核心病理特征。尽管遗传背景的差异可能导致临床异质性，但进化上保守的神经发育通路（如突触可塑性调控）可能通过跨人群共享的核心基因发挥作用，只是受到群体特异性变异的影响。

目前对SCZ遗传基础的理解仍存在几个关键问题：首先，大多数GWAS研究集中于单一人群（主要是欧洲人群），缺乏跨人群验证。其次，对风险基因在特定细胞类型和发育阶段的动态表达模式了解甚少。最后，遗传变异与表观遗传调控网络相互作用的潜在机制，以及基因转录调控在SCZ中的作用尚不明确。这些知识缺口阻碍了对SCZ发病机制的全面理解，也制约了精准疗法的发展。

为了克服传统单一方法分析的局限性，研究人员开展了一项整合多组学数据的研究。该研究的独特优势体现在三个方面：第一，整合欧洲和东亚人群的GWAS数据进行跨人群验证，增强了结果的可靠性。第二，利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）解析风险基因的细胞类型特异性表达模式，为SCZ的细胞病理学提供了新见解。第三，通过实验验证（如CUT&Tag和RNA测序）探究关键基因的功能机制，为研究发现提供了坚实的生物学基础。

该研究旨在识别SCZ核心风险基因网络，并描绘其在神经发育过程中的时空调控动态。通过系统分析遗传变异、基因表达和表观遗传调控之间的相互作用，研究人员希望阐明SCZ的分子机制，并促进基于病理学的治疗靶点发现。相关研究成果发表在《Schizophrenia》期刊上。

为开展此项研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术：整合了欧洲（N=130,644）和东亚（N=30,761）人群的精神分裂症GWAS汇总数据；利用多组学方法，包括多标记基因组注释分析（MAGMA）、基于汇总数据的孟德尔随机化（SMR）、转录组范围关联研究（TWAS）、多性状贝叶斯关联检验组合方法（mBAT-combo）和表型导向通路评分（POPS）；分析了来自人眶额叶皮层（87个个体，约80万个细胞核）和全脑（3名捐献者，105个脑区，约337万个细胞核）的单核RNA测序（snRNA-seq）数据，以及携带NRXN1缺失的人诱导多能干细胞（iPSC）来源脑类器官的scRNA-seq数据；通过CUT&Tag技术检测RERE蛋白的DNA结合位点，并利用RNA测序（RNA-seq）分析RERE过表达后的转录组变化；对背外侧前额叶皮层（DLPFC）第3层和第5层锥体神经元的基因表达谱（GEP）数据进行加权基因共表达网络分析（WGCNA）。

基因组显著SNV、基因和通路富集分析

在欧洲人群队列中，研究人员在基因组显著水平（P < 5×10^-8）上识别出17,162个显著单核苷酸变异（SNV），其中681个为有害变异（CADD评分 > 12.37）。而在东亚人群队列中仅检测到706个显著SNV（33个有害变异）。跨人群重叠的显著SNV有91个，包含15个有害变异。

MAGMA分析显示，在欧洲队列中有3,006个显著基因（FDR校正P值 < 0.05），其中104个基因的POPS评分 > 1。东亚队列的显著基因较少（155个，4个POPS>1），两个队列之间仅共享两个重叠基因。

尽管两个队列的显著基因数量存在显著差异，但它们富集的功能通路高度一致，主要集中于细胞粘附、突触组织和轴突导向等神经发育通路。

组织特异性、时空动态表达和细胞类型特异性富集分析

组织特异性分析表明，欧洲队列的显著基因广泛富集于黑质、杏仁核和壳核等脑区（FDR校正P值 < 0.05），而东亚队列富集的组织较少。但两个队列均在这些脑区检测到显著上调的差异表达基因。

基于BrainSpan数据库的时空动态分析进一步揭示，欧洲队列的显著基因在孕中期晚期和儿童早期最为活跃（FDR校正P值 < 0.05）。尽管东亚队列未达到统计学显著性，但其峰值富集阶段与欧洲队列一致。

细胞类型特异性富集分析表明，两个队列的显著基因均集中在特定的神经元细胞类型中，包括GABA能神经元、与HDAC1表达或功能相关的神经元，以及可能未成熟的GABA能神经母细胞。

SMR和TWAS分析揭示关键靶基因

通过整合SMR和TWAS分析，欧洲队列分别识别出1,291和2,109个与SCZ显著相关的基因，主要富集于小脑、皮层和基底节等脑组织。MAGMA识别的组织特异性（如黑质、杏仁核和壳核）也在SMR/TWAS中得到验证。东亚队列的显著基因较少（SMR=9, TWAS=99），但其富集模式与欧洲队列高度相似。

mBAT-combo分析鉴定核心靶基因

mBAT-combo分析通过交叉验证MAGMA、POPS、SMR和TWAS的基因，筛选出七个核心靶基因（MDK、RERE、ERBB4、CNTN4、ASAP1、NEGR1、TRPS1；FDR校正P值 < 0.05，POPS > 1）。

值得注意的是，在所有鉴定的枢纽基因中，RERE在SMR中显示出多个顶级SNP（rs894875, rs2708633, rs301818），在SCZ GWAS水平上具有提示性显著性（p_GWAS< 1.60×10^-7，p_HEIDI> 0.01）。进一步的共定位分析显示，在上述组织或细胞中，SCZ GWAS与RERE eQTLs存在共享因果变异的高概率（92.8%-93.9%，PP.H4.abf），进一步支持了RERE在SCZ发病中的潜在作用。

在东亚队列中，符合如此严格筛选标准的显著基因过少，未能鉴定出靶基因。然而，与欧洲队列相比，RERE在所有分析方法中均显示出近乎一致的提示性结果，尽管显著性水平明显较低（P < 0.05，FDR校正P值 > 0.05）。欧洲和东亚队列的研究结果一致地表明，RERE是与SCZ相关的关键基因。

绘制SCZ的细胞病因学图谱

为了进一步描绘SCZ风险基因在不同神经元亚群中的表达模式，研究人员采用了Duncan等人开发的一种创新方法。通过整合SCZ GWAS风险基因与scRNA-seq数据，他们发现这些风险基因在107个神经元亚型中显著富集（Bonferroni校正P值 < 0.05）。

具体而言，不同的靶基因表现出不同的细胞亚群特异性：MDK主要富集于Splatter和CGE中间神经元；RERE和CNTN4主要富集于中脑来源的抑制性神经元和MGE中间神经元；ERBB4主要富集于CGE中间神经元；ASAP1和TRPS1主要与LAMP5-LHX6和胆碱能神经元相关；NEGR1在MGE中间神经元和偏心中型多棘神经元中显著富集。

通过前向选择分析，研究人员确定了独立显著的细胞类型，包括MGE中间神经元、CGE中间神经元和深层皮质丘脑投射神经元（特别是第6b层的皮质丘脑投射神经元）。值得注意的是，MGE和CGE中间神经元被注释为GABA能神经元，凸显了GABA能系统在SCZ发病中的核心作用。相比之下，深层皮质丘脑投射神经元是谷氨酸能（VGLUT1⁺）的，这与它们作为兴奋性输出神经元的作用一致。这些发现表明，SCZ涉及GABA能中间神经元功能障碍和兴奋性投射回路失调，可能破坏了皮质-丘脑网络内的兴奋-抑制平衡。

scRNA-seq揭示靶基因的差异表达

为了进一步验证靶基因在SCZ患者和健康对照者不同细胞类型中的差异表达，研究人员分析了一个独立的scRNA-seq数据集。结果显示，在SCZ患者中，RERE在少突胶质细胞前体细胞（OPC）、神经祖细胞、抑制性神经元和兴奋性神经元中显著上调（log₂FC > 0.05，FDR校正P值 < 0.05），但在小胶质细胞和星形胶质细胞中显著下调（log₂FC < 0.05，FDR校正P值 < 0.05）。ERBB4在抑制性神经元和少突胶质细胞前体中显著上调，但在神经祖细胞中下调。CNTN4在神经祖细胞中显著上调，但在兴奋性神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞中下调。NEGR1在少突胶质细胞中显著下调。TRPS1在神经祖细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞和星形胶质细胞中显著上调。

基于BrainSpan元数据验证RERE的表达轨迹

为了进一步理解靶基因RERE在星形胶质细胞中eQTL和scRNA-seq结果矛盾的原因，研究人员首先使用BrainSpan元数据验证了RERE的表达轨迹。结果显示，RERE在神经板中的表达基本保持稳定，但在异源皮层、基底核和丘脑中表现出早期高表达随后逐渐下降的模式。神经板主要包含神经元前体细胞和分化中的神经元，表明RERE可能在神经元谱系（从神经前体到成熟神经元）中发挥持续稳定的作用。相比之下，异源皮层、丘脑和基底核等区域在出生后经历活跃的胶质细胞生成（例如，基底核中的少突胶质细胞和丘脑中的星形胶质细胞）。观察到的RERE表达模式提示其可能在胶质细胞分化和发育过程中下调。

iPSC来源人脑类器官的scRNA-seq分析

为了研究RERE在SCZ相关神经发育扰动背景下的发育调控，研究人员分析了一个成熟的SCZ iPSC来源脑类器官模型的scRNA-seq数据。该模型携带NRXN1（2p16.3）位点的杂合缺失（这是SCZ的高置信度遗传风险因子），并重现了皮质发育过程中SCZ相关的关键转录组和功能异常。

结果显示，在SCZ组中，2月龄的外侧放射状胶质细胞（oRG）（log₂FC = 1.595，FDR校正P值 = 0.006）和3.5月龄的放射状胶质样细胞（RG-like）（log₂FC = 0.385，FDR校正P值 = 8.34×10^-5）显著上调，而在星形胶质细胞中未检测到差异（星形胶质细胞罕见，S100B⁺细胞仅在3.5月龄的类器官中开始出现）。在胚胎大脑发育过程中，放射状胶质细胞（包括oRG和RG-like细胞）是神经祖细胞的主要来源。它们通过不对称分裂产生神经元、中间祖细胞（IPC）和胶质细胞（包括星形胶质细胞）。

基于mQTL的RERE甲基化分析

为了在分子水平上进一步阐明这种复杂性，研究人员还对SCZ GWAS进行了mQTL的SMR分析，以探索甲基化、基因表达和性状之间的潜在联系。结果显示，在脑组织中，RERE的两个甲基化位点cg00786138（topSNP: rs302714）和cg00120948（topSNP: rs301806）显著降低了SCZ风险（b_SMR< 0，FDR校正P值 < 0.05，p_HEIDI> 0.01）。

CUT&Tag和RNA-seq分析

为了研究RERE的转录调控功能，研究人员在小鼠海马神经元HT22细胞中过表达了RERE，并进行了CUT&Tag和RNA-seq分析。结果显示，RERE蛋白在696个基因的启动子区域（≤ 3 kb）显著富集（富集倍数 > 5，-log₁₀(q值) > 2）。对RNA-seq数据进行WGCNA分析（通过pickSoftThreshold函数确定软阈值为9），识别出六个基因模块。其中，与RERE共表达的蓝绿色模块包含6,636个基因。

为了鉴定在人和小鼠中可能保守的RERE靶基因，研究人员分析了Arion等人发表的DLPFC第3层（L3）和第5层（L5）锥体神经元的GEP数据。首先，在四个组（L3对照组、L3 SCZ组、L5对照组、L5 SCZ组）之间进行了Kruskal-Wallis秩和检验的差异表达分析。值得注意的是，RERE在L5 SCZ组中显著上调（对照L5：5.65 ± 0.60；SCZ L5：6.03 ± 0.60；P = 0.01），但在L3神经元中未观察到差异（P = 0.90）。此外，在对照组中，L5和L3神经元之间的RERE表达存在显著差异（对照L3：6.01 ± 0.60；对照L5：5.65 ± 0.60；P = 0.01），但在SCZ组中没有，这凸显了不同神经元亚型之间复杂的转录调控。

对L5神经元GEP数据的进一步WGCNA分析（软阈值=2）识别出八个基因模块，包括与RERE共表达的浅绿色模块，该模块包含277个基因。相关性分析显示，浅绿色模块与SCZ风险显著正相关（相关系数 = 0.33，P = 0.008）。浅绿色模块中的模块成员性与SCZ L5组的基因显著性也呈显著正相关（相关系数 = 0.36，P = 1.1×10^-9）。将来自人DLPFC和HT22数据集的RERE共表达基因取交集，得到62个保守基因。通路富集分析表明，这些基因可能通过调控钙信号、突触功能和RNA代谢相关基因，在SCZ发病中发挥核心作用，可能导致神经元兴奋性失衡和突触缺陷。

在CUT&Tag中，研究人员检测到RERE在两个共表达基因PPP4R3B和RPS27L的启动子区域有显著的结合信号，表明它们受RERE的直接转录调控。Motif分析在PPP4R3B结合位点附近识别出ARG81（GAGTCA）和IRF6（CCGAAA）的潜在结合位点，而在RPS27L结合位点附近发现了IRF6（CCGAAA）和KLF4（GTGTA）的motif，提示这些因子可能与RERE共同调控靶基因。值得注意的是，IRF6和KLF4也被鉴定为RERE的共表达基因，支持它们与RERE形成调控复合物以调节PPP4R3B和RPS27L转录，从而协同参与SCZ发病的潜在作用。

本研究通过整合欧洲和东亚人群的大规模GWAS数据，系统研究了SCZ的遗传基础和基因表达特征。研究发现，尽管不同人群之间存在显著的遗传异质性，但SCZ的病理机制可能通过保守的神经发育通路（如细胞粘附和突触组织）汇聚。通过多组学分析，研究人员鉴定出七个核心风险基因（如MDK和RERE），其中RERE表现出极高的eQTL-SCZ共定位概率。

单细胞分析扩展了关于风险基因RERE细胞富集的有