极长链脂肪酸驱动1-脱氧鞘脂毒性的分子机制揭示：靶向ELOVL1作为治疗新策略

《Nature Communications》：Very long-chain fatty acids drive 1-deoxySphingolipid toxicity

　　本研究聚焦于1-脱氧鞘脂(1-deoxySLs)毒性机制不清的难题。研究人员通过CRISPRi筛选、功能脂质组学及药理学干预，系统阐明了极长链(VLC)1-脱氧二氢神经酰胺（特别是m18:0/24:1）是核心毒性介质，其通过诱导线粒体通透性转换孔(mPTP)开放和BAX激活导致细胞死亡。研究证实抑制脂肪酸延长酶ELOVL1可有效阻断毒性脂质生成，为遗传性感觉神经病1型(HSAN1)和糖尿病神经病变等疾病提供了新的治疗靶点。

　　

在生命科学的精密网络中，鞘脂（Sphingolipids, SL）作为一类具有重要生物活性的脂质分子，扮演着维持细胞结构、信号传导和能量代谢等多重关键角色。然而，当鞘脂的正常合成途径出现“偏差”时，便可能产生具有细胞毒性的“异常分子”，其中1-脱氧鞘脂（1-deoxysphingolipids, 1-deoxySLs）便是这样一个令人瞩目的焦点。1-脱氧鞘脂的产生源于丝氨酸棕榈酰转移酶（Serine Palmitoyltransferase, SPT）在催化起始反应时，错误地利用了L-丙氨酸（L-alanine）而非L-丝氨酸（L-serine）作为底物。这一微小的底物替换，导致生成的鞘氨醇碱基（Long-Chain Base, LCB）在C1位置缺少了一个至关重要的羟基，从而使其成为一类无法通过经典途径进一步代谢或降解的“孤儿脂质”。

病理状态下，1-脱氧鞘脂的异常积累与多种神经系统疾病密切相关，其中最典型的是遗传性感觉自主神经病1型（Hereditary Sensory and Autonomic Neuropathy Type 1, HSAN1）和糖尿病神经病变（Diabetic Neuropathy）。患者常表现为进行性的感觉丧失，尤其是痛温觉障碍，严重影响了生活质量。尽管临床关联明确，但1-脱氧鞘脂究竟通过何种分子机制对细胞（尤其是神经元）施加毒性作用，长期以来一直是一个悬而未解的谜团。是游离的1-脱氧鞘氨醇（1-deoxysphinganine, 1-deoxySa）本身有毒，还是其后续代谢产物是元凶？毒性是否与脂质分子上连接的脂肪酸链长度有关？这些问题亟待解答。为了解决这些关键科学问题，由Adam Majcher和Thorsten Hornemann等人组成的研究团队开展了一项系统性的研究，其成果最终发表在顶级学术期刊《Nature Communications》上。

本研究综合运用了多种关键技术方法。研究人员首先利用全基因组CRISPR干扰（CRISPR interference, CRISPRi）筛选技术，在K562细胞模型中系统寻找调控1-deoxySL毒性的关键基因。在此基础上，通过稳定同位素（如d₃-1-deoxySa）标记的代谢流分析（isotopic flux assay）结合高分辨率液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）脂质组学，精确追踪了1-deoxySL在细胞内的代谢命运。功能验证方面，研究采用了小干扰RNA（siRNA）敲低和CRISPR-Cas9基因敲除技术，在HeLa细胞中特异性沉默或敲除候选基因（如ELOVL1, CERS2）。药理学实验中，使用了临床前验证的ELOVL1小分子抑制剂Compound 22。此外，研究还利用鸡胚背根神经节（Dorsal Root Ganglion, DRG）原代神经元模型评估神经毒性，并通过线粒体功能分析（如Seahorse能量代谢分析仪）、线粒体肿胀实验等，深入探究了毒性作用的细胞器水平机制。

1-deoxyDHCeramides are the primary mediators of 1-deoxySphingolipids induced toxicity

为了确定1-deoxySL毒性的直接介质，研究人员首先使用了已知的神经酰胺合成酶（Ceramide Synthase, CERS）抑制剂伏马菌素B1（Fumonisin B1, FB1）。结果证实，FB1能显著缓解1-deoxySa诱导的细胞毒性。进一步的代谢流分析显示，FB1处理导致游离的1-deoxySa和1-deoxySo积累，同时抑制了N-酰化产物（如1-deoxyDHCer和1-deoxyCer）的生成，提示毒性可能源于后者。接着，团队比较了饱和的1-deoxySa和其不饱和类似物1-deoxySo（由脂肪酸脱饱和酶3, FADS3催化生成）的毒性，发现1-deoxySa的毒性远高于1-deoxySo。脂质组学分析表明，1-deoxySa主要转化为1-deoxyDHCer和1-deoxyCer，而1-deoxySo则几乎只生成1-deoxyCer。这些数据共同表明，饱和的N-酰化产物，特别是1-deoxyDHCer，是1-deoxySL细胞毒性的主要介质。

CRISPRi toxicity screen identifies gene candidates responsible for 1-deoxySphingolipids toxicity

为了系统性筛选与1-deoxySL毒性相关的基因，研究团队在K562细胞中进行了全基因组CRISPRi毒性筛选。筛选结果鉴定出5个基因的敲低能显著增强细胞对1-deoxySa的耐受性。这些基因均与脂肪酸延长或鞘脂合成密切相关，包括：ELOVL1（极长链脂肪酸延长酶1）、HSD17B12、ACACA、PTPLB和CERS2（神经酰胺合成酶2，偏好利用极长链脂肪酸）。值得注意的是，ELOVL1负责将酰基辅酶A延长为极长链脂肪酸（如C24:0, C24:1），这些脂肪酸正是CERS2的底物，用于合成极长链1-deoxyDHCer。相反，FADS3被鉴定为敏感基因，其敲低加剧毒性，这与FADS3催化生成低毒性不饱和1-deoxySo的保护作用一致。基因集富集分析进一步证实，脂肪酸延长和生物合成通路在介导毒性中扮演核心角色。

Silencing of ELOVL1 and CERS2 expression confirms their role in 1-deoxysphingolipid mediated toxicity

基于筛选结果，研究人员对ELOVL1和CERS2进行了深入的功能验证。在HeLa细胞中，通过siRNA敲低或CRISPR-Cas9敲除ELOVL1，均导致代谢流从极长链1-deoxyDHCer（如m_18:0/24:0和m_18:0/24:1）向长链1-deoxyDHCer（如m_18:0/16:0, m_18:0/18:0）转移，并显著缓解了1-deoxySa的毒性。同样，敲除CERS2（偏好极长链底物）也降低了极长链1-deoxyDHCer水平并产生保护效应，而敲除偏好长链底物的CERS5/6则对毒性影响甚微。这些结果确证了ELOVL1和CERS2是通过合成极长链1-deoxyDHCer来驱动1-deoxySL毒性的关键酶。

Pharmacological inhibition of ELOVL1 mitigates 1-deoxysphingolipids induced mitochondrial and neuronal toxicity

鉴于遗传学干预的有效性，研究团队进一步探索了药理学抑制ELOVL1的治疗潜力。他们使用了先前为治疗X-连锁肾上腺脑白质营养不良症（X-linked adrenoleukodystrophy, X-ALD）而开发的ELOVL1小分子抑制剂Compound 22。在HeLa细胞中，Compound 22处理成功模拟了遗传学干预的效果，即减少极长链1-deoxyDHCer生成，增加长链1-deoxyDHCer，并有效抵抗了1-deoxySa的毒性。更重要的是，Compound 22能够完全逆转1-deoxySa引起的线粒体呼吸功能和糖酵解能力损伤。在生理相关性更强的鸡胚背根神经节（DRG）原代神经元模型中，Compound 22同样显示出代谢活性，能改变DRG中的1-deoxySL谱系，并显著挽救1-deoxySa引起的神经元轴突退化，证明了其神经保护作用。

Nervonyl-1-deoxyDHCeramide(m_18:0/24:1) is the strongest inductor of mitochondrial damage and cellular toxicity

最后，研究旨在精确解析不同链长1-deoxyDHCer物种的毒性差异。通过在ELOVL1抑制剂（Compound 22）存在下分别补充棕榈酸（16:0）、木蜡酸（24:0）和神经酸（24:1），研究人员能够特异性地诱导细胞产生相应链长的1-deoxyDHCer。毒性实验表明，源自神经酸（24:1）的神经酰-1-脱氧二氢神经酰胺（nervonyl-1-deoxyDHCer, m_18:0/24:1）毒性最强，其次为m_18:0/24:0和m_18:0/16:0。在线粒体水平，直接使用合成的脂质分子处理分离的小鼠肝脏线粒体，发现m_18:0/24:1能引起最显著的线粒体肿胀，这是线粒体通透性转换孔（mitochondrial Permeability Transition Pore, mPTP）开放的标志。mPTP抑制剂环孢素A（Cyclosporin A, CsA）可以抑制这种肿胀。在细胞实验中，CsA和BAX（促凋亡蛋白）抑制剂肽V5均能保护细胞免受1-deoxySa诱导的死亡。这些结果揭示了1-deoxySL，特别是m_18:0/24:1，通过诱导线粒体mPTP开放和后续的BAX依赖性凋亡信号通路，从而导致细胞死亡的全新分子机制。

综上所述，这项研究首次清晰地阐明了1-脱氧鞘脂毒性的分子路径：极长链脂肪酸（特别是C24:1）通过ELOVL1和CERS2的级联反应，被整合到1-脱氧鞘氨醇碱基上，形成高毒性的1-deoxyDHCer（主要是m_18:0/24:1）；该脂质分子直接靶向并破坏线粒体膜稳定性，引发mPTP开放和BAX介导的细胞凋亡。这项工作的意义重大，它不仅解答了该领域长期存在的核心问题，将1-deoxySL的化学结构（碱基饱和度、N-酰基链长度和饱和度）与其细胞毒性直接联系起来，更重要的是，它提出了靶向脂肪酸延长酶ELOVL1作为一种全新的、具有转化医学潜力的治疗策略，为HSAN1、糖尿病神经病变等由1-deoxySL积累引起的疾病提供了新的希望和干预方向。