TECPR2作为Rab5效应因子调控早期内体货物回收的新机制及其在神经退行性疾病中的作用

《Nature Communications》：The neuropathy-linked protein TECPR2 is a Rab5 effector that regulates cargo recycling from early endosomes

　　本研究揭示了遗传性感觉和自主神经病变（HSAN）相关蛋白TECPR2作为早期内体小G蛋白Rab5的新型效应因子，通过调控整合素等货物受体的回收过程维持细胞功能。研究人员发现TECPR2与SNX17和WASH复合物相互作用，促进肌动蛋白依赖性的货物回收，而HSAN相关突变会破坏TECPR2与Rab5的结合能力，导致整合素回收障碍和溶酶体降解。该研究为理解TECPR2突变导致神经退行性疾病的分子机制提供了新见解。

　　

在细胞的生命活动中，囊泡运输如同一个精密的物流系统，负责将各种"货物"——蛋白质和脂质等——在细胞内的不同隔室间进行转运。这一过程由小G蛋白（如Rab、Arf和Arl家族成员）精密调控，它们像分子开关一样，在特定膜区室上招募效应蛋白，进而控制囊泡的出芽、运动和锚定等关键步骤。其中，Rab5和Rab7是内体运输通路中的两个关键调控因子，分别负责早期内体和晚期内体的功能。然而，这一复杂系统中仍有许多未知之处，尤其是某些遗传性神经系统疾病相关的蛋白在内体运输中的具体功能尚不清楚。

Tectonin-β-propeller重复包含蛋白2（TECPR2）正是这样一个令人困惑的蛋白。早在2012年，研究人员就发现TECPR2基因突变与一种罕见的遗传性感觉和自主神经病变（HSAN9，之前称为痉挛性截瘫49型）相关。这种疾病是一种神经发育性和神经退行性障碍，患者会逐渐丧失自主神经和感觉功能。虽然已知TECPR2与自噬相关蛋白LC3/GABARAP以及HOPS复合物等存在相互作用，但它在细胞中的精确功能和位置，以及其突变如何导致神经系统疾病，仍然是个未解之谜。

更令人困惑的是，不同研究对TECPR2的定位报告不一——有的发现它与内质网、内质网出口位点（ERES）以及ER-高尔基体中间区室有关，参与分泌途径；而另一些研究则提示它可能在自噬体-溶酶体融合等自噬晚期步骤中发挥作用。这种定位的不确定性限制了对TECPR2功能的理解。

为了解决这些谜团，印度科学教育与研究学院莫哈利分校Mahak Sharma领导的研究团队开展了一项深入研究。他们的研究出发点很明确：既然小G蛋白是调控细胞内囊泡运输的关键分子，那么TECPR2是否可能是某个Rab蛋白的效应因子？这一假设引导他们发现了一个重要的生物学故事——TECPR2实际上是Rab5的新型效应因子，在早期内体上调控货物回收过程中发挥关键作用。这一研究成果近期发表在《Nature Communications》上。

为了开展这项研究，研究人员运用了多种先进的细胞分子生物学技术。他们通过酵母双杂交筛选发现了TECPR2与Rab5的相互作用，并通过免疫共沉淀实验验证了这一相互作用具有GTP依赖性。研究团队还构建了TECPR2的不同结构域缺失突变体，确定其C端TECPR重复区域（935-1411氨基酸）是Rab5结合的关键区域。值得注意的是，他们发现HSAN相关的TECPR2错义突变体（D1000Y、W1140G和R1336W）与Rab5的结合能力显著降低。

在细胞定位方面，研究人员通过免疫荧光和活细胞成像技术证实TECPR2定位于早期内体，并且这种定位依赖于Rab5。他们还使用铁流体（FF）标记的内体分离技术，从内源性水平验证了TECPR2在早期内体组分中的富集。特别有趣的是，他们开发了一种线粒体靶向系统（MitoID），证明GTP结合的Rab5足以将TECPR2招募至线粒体膜上，而HSAN相关的TECPR2（R1336W）突变体则无此能力。

为了在更接近生理条件下的系统中验证这一相互作用，研究团队还使用了一种创新的体外重构实验——他们将纯化的Rab5锚定在巨型单层囊泡（GUV）上，并证明TECPR2的C端区域可直接与GTP结合的Rab5相互作用，而R1336W突变体则失去此能力。

在技术方法上，本研究还涉及了蛋白质纯化和体外结合实验、免疫荧光和共聚焦显微镜、铁流体标记的内体分离、表面生物素化分析、流式细胞术、酵母双杂交、免疫共沉淀、GUV实验、斑马鱼基因敲低和表型分析等多种技术手段。

TECPR2直接通过其C端TECPR重复区域与Rab5结合

研究人员首先通过酵母双杂交筛选发现，在测试的20种哺乳动物Rab蛋白中，TECPR2与组成型活性形式的Rab5（Q79L）和Rab29（Q67L）存在相互作用。他们进一步验证了TECPR2特异性地与GTP结合形式的Rab5相互作用，而不与GDP结合形式相互作用。通过结构域缺失实验，团队确定TECPR2的C端TECPR重复区域（935-1411氨基酸）是与Rab5结合的关键区域。

尤为重要的是，研究人员发现HSAN相关的错义突变体TECPR2（D1000Y）、（W1140G）和（R1336W）与Rab5的结合能力显著降低，而（T903M）突变体则保持与野生型相似的结合能力。这些发现不仅揭示了TECPR2与Rab5的相互作用机制，还提示HSAN相关突变可能通过破坏这一相互作用而导致疾病。

HSAN相关的TECPR2错义变异体破坏其与Rab5的结合

研究人员对HSAN相关的TECPR2变异体进行了详细分析。值得注意的是，TECPR2（D1000Y）、（W1140G）和（R1336W）变异体在细胞裂解液中的表达量远低于野生型蛋白，而（T903M）变异体的表达与野生型相似。特别是（W1140G）变异体没有显示出与野生型分子量（约180 kDa）对应的条带，而是出现了无法解释的向下迁移。这些变异体与Rab5结合能力的丧失或显著降低，可能是HSAN9疾病的致病机制之一。

TECPR2以Rab5依赖性方式定位于早期内体，此过程在HSAN相关的R1336W变异体中被破坏

通过免疫荧光和活细胞成像，研究人员发现GFP标记的TECPR2虽然主要分布在细胞质中，但也呈现点状定位，且这些点状结构与Rab5及其效应因子EEA1（早期内体抗原1）共定位，而与晚期内体/溶酶体标志物Rab7和LAMP1几乎没有共定位。通过铁流体标记的内体分离实验，他们从内源性水平证实TECPR2在早期内体组分中富集。

研究还发现，Rab5对于TECPR2的膜定位至关重要。当共表达Rab5的组成型活性突变体（Q79L）时，TECPR2被招募至膜上；而当表达Rab5的组成型阴性突变体（S34N）时，TECPR2则完全分布在细胞质中。重要的是，与Rab5结合能力缺陷的HSAN9相关TECPR2变异体在Rab5存在时也保持细胞质分布。

TECPR2定位于并维持早期和回收内体的外周分布

活细胞成像显示，TECPR2阳性的早期内体具有动态特性，包括外周较小内体的双向运动和中环状较大内体的相对静止。研究人员还观察到TECPR2阳性内体出芽形成短管状结构以及同型融合事件。当细胞摄入标记的转铁蛋白（Tfn-568）后，Tfn-568出现在TECPR2阳性的内体和管状结构上，这些结构最终发生分裂，表明TECPR2阳性区室可接触到内吞的货物。

TECPR2与整合素分选适配器SNX17相互作用并调控其向Rab5阳性内体的定位

研究人员发现TECPR2与SNX17存在相互作用，并通过免疫共沉淀和体外结合实验验证了这一相互作用。重要的是，TECPR2缺失导致SNX17在早期内体上的定位减少。酵母双杂交和体外结合实验表明，SNX17与TECPR2的C端TECPR重复区域相互作用，且这种相互作用不同于TECPR2与Rab5的结合界面。

研究还发现TECPR2作为SNX17和Rab5之间的连接器，促进SNX17招募至早期内体。TECPR2缺失细胞中，SNX17与Rab5的共定位显著降低，且内源性SNX17在早期内体组分中的水平下降。

TECPR2缺失损害肌动蛋白成核促进因子WASH复合物在早期内体上的定位

研究人员发现TECPR2与WASH复合物的亚基WASHC2/FAM21和WASHC5/Strumpellin相互作用，并在膜上共定位。TECPR2缺失导致WASH复合物亚基（Strumpellin和WASHC1）在早期内体上的定位减少，Arp2/3复合物在早期内体上的招募也减少。此外，TECPR2缺失细胞的整体肌动蛋白标记（鬼笔环肽）也显著减少，表明TECPR2调控早期内体上的分支肌动蛋白丝形成。

TECPR2介导β1整合素受体从溶酶体降解中的回收

功能实验表明，TECPR2缺失导致细胞铺展减少、粘着斑组装受损。研究人员发现TECPR2缺失细胞中活性整合素β1（Itgβ1）的表面水平降低，内吞的Itgβ1回收受损。共定位分析显示，TECPR2缺失导致Itgβ1与溶酶体标志物的共定位增加，而溶酶体V-ATPase抑制剂BafA1处理可挽救成熟Itgβ1的水平，表明Itgβ1在TECPR2缺失细胞中被溶酶体降解。

斑马鱼中TECPR2敲低导致孵化缺陷和运动能力受损

在斑马鱼模型中，研究人员发现Tecpr2与Rab5的相互作用在进化上保守，且R1234W突变（对应人类R1336W）破坏了这一相互作用。Tecpr2敲低导致胚胎存活率降低、孵化缺陷、体长减小、心包水肿和运动能力受损。这些表型可通过注射野生型tecpr2 mRNA挽救，而突变型tecpr2（R1234W）mRNA则无挽救作用。组织学分析显示，Tecpr2敲低导致神经肌肉接头（NMJ）形态改变，从 elongated and branched structures 变为 smaller and punctate-like structures。

本研究系统揭示了TECPR2作为Rab5效应因子的新功能，阐明了其在早期内体货物回收中的关键作用。研究人员发现TECPR通过与SNX17和WASH复合物相互作用，促进肌动蛋白依赖性的货物回收，防止货物受体被错误靶向至溶酶体降解途径。HSAN相关的TECPR2突变体因破坏与Rab5的相互作用而丧失功能，导致整合素等货物受体的回收障碍，这可能是HSAN9疾病的分子机制之一。

这些发现不仅深化了对细胞内囊泡运输机制的理解，也为相关神经退行性疾病的治疗策略开发提供了新靶点。特别值得注意的是，TECPR2调控的整合素回收通路与细胞粘附、铺展和迁移等重要生理过程密切相关，这为理解HSAN9疾病的病理生理机制提供了新视角。此外，研究建立的斑马鱼模型为未来筛选治疗化合物提供了有用平台。

未来的研究方向可能包括进一步阐明TECPR2在神经元中的具体功能，研究其是否通过相分离机制形成功能区室，以及探索其与其它神经退行性疾病相关蛋白的相互作用网络。这些研究将有助于全面理解TECPR2在细胞功能和人类健康中的重要作用。