由聚焦飞秒激光刺激引发的神经元电活动的时空模式

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Spatiotemporal patterns of neuronal electrical activity evoked by stimulation with a focused femtosecond laser

　　本研究利用聚焦飞秒激光对单个神经元进行刺激，通过微电极阵列测量发现，激光刺激引发高频动作电位，降低神经元同步性，并延长局部爆发持续时间，表明激光刺激为研究神经元网络功能连接提供了新方法。

　　

关川由美|美之岛渡|增井京子|星川千惠

大阪都市大学理学研究科化学系，日本大阪住吉区杉本3-3-138，558-8585

摘要

神经网络表现出时空模式的电活动，例如神经元群体的脉冲位置、脉冲时序和爆发性放电。这些神经活动的时空模式在大脑功能中起着重要作用，并会受到外部刺激的影响。通过单神经元刺激和测量神经网络反应，可以有效阐明复杂神经网络中的信息处理机制。利用聚焦飞秒激光进行的多光子吸收技术实现的单细胞刺激有可能激活神经网络。在本研究中，我们利用微电极阵列测量方法，研究了聚焦飞秒激光引发的神经网络活动的时空模式，特别是放电率、神经元活动的同步性以及爆发特性。我们观察到激光照射引发了高频脉冲。通过比较电刺激引发的脉冲模式，发现激光照射降低了神经网络活动的同步性。此外，激光照射还延长了局部神经元的放电持续时间。这些结果表明，激光诱导的刺激为在单细胞水平上研究神经网络的功能连接性提供了一种自下而上的方法。

引言

在哺乳动物大脑中，数十亿个神经元通过突触传递表现出电活动。大脑通过编码神经元中的时空电活动模式来处理信息[1]。测量和表征复杂的神经活动模式有助于理解大脑的信息处理过程。人们已经尝试利用电生理记录方法将神经活动模式与大脑功能联系起来[2]、[3]、[4]。先前的研究表明，外部刺激输入会改变神经元群体中的时空电活动模式，包括稀疏脉冲和爆发性活动[5]、[6]、[7]、[8]。在记忆过程中会出现重复的神经活动模式，这与记忆存储有关[9]、[10]。因此，研究神经网络对外部刺激输入的爆发活动和同步性有助于我们理解与记忆和学习相关的大脑功能。体外培养的初级分离神经元能够形成并维持新的复杂神经回路结构[11]、[12]，作为简化的脑模型，因为这些系统保留了可兴奋膜的电生理特性和体内系统可动态调节的突触强度[13]。然而，培养的神经网络并不能完全模拟体内的网络结构，例如其复杂性和胶质细胞的数量。此外，在培养的神经网络中，单个神经元通过突触连接，这些突触表现出无尺度拓扑结构[14]以及大小依赖性的神经元爆发活动[15]，这种现象在脑切片[16]、[17]和体内任务驱动活动中也有观察到[18]、[19]。

研究单个神经元的放电与网络活动之间的关系有助于理解大脑中的复杂神经活动。在单细胞水平上的外部输入有助于我们理解神经活动的动态。已经使用了多种刺激方法来操纵神经元的放电特性和功能连接性，包括电刺激[20]、药物治疗[21]、[22]以及光遗传学[23]、[24]、[25]。然而，这些传统方法无法在不进行基因修饰的情况下在单细胞水平上操纵神经元。

在本研究中，使用聚焦飞秒激光在微电极阵列（MEA）基底上刺激神经网络中的单个神经元。先前的研究表明，基于多光子吸收的激光诱导的消融会暂时破坏神经元膜，并且使用膜片钳[26]和MEA记录[27]、[28]在培养的神经网络中引发了高频神经电活动。然而，激光引发的神经活动的详细时空模式尚未被量化。我们利用多点细胞外电位记录方法评估了激光照射引起的神经元同步活动。

章节摘录

在MEA上培养海马神经网络

所有关于初级培养的大鼠海马神经元的动物实验均获得了大阪都市大学动物实验规定的批准。海马组织从18天大的大鼠胚胎（Wistar/ST，日本SLC）中提取。组织用0.063%的胰蛋白酶（Thermo Fisher Scientific）消化，并通过温和的机械吸移技术分离成单个细胞。海马细胞以1.3 × 10⁵细胞/cm²的密度接种在聚乙烯亚胺涂层的MEA（MED探针；Alpha

飞秒激光照射后神经网络中的细胞内Ca²⁺升高和细胞外电位脉冲增加

先前的研究表明，海马和皮质神经网络的放电率增加，并开始表现出同步的爆发性活动，这是接种后两到三周出现的特征性现象[6]、[37]、[38]、[39]、[40]。因此，我们使用18–23 DIV龄的海马神经网络来分析飞秒激光照射和电刺激引发的神经活动的特征性时空脉冲模式。

讨论

我们研究了飞秒激光照射单个神经元在神经网络中引发的神经活动的时空模式。激光诱导的刺激与电刺激引发的电活动模式在脉冲活动模式和放电率上存在差异（图3）。这些活动模式和放电率的差异源于激光照射与传统电刺激的刺激机制不同。

结论

在MEA上培养的海马神经元中评估了聚焦飞秒激光引发的响应的时空模式。激光照射后，目标神经元中的细胞内Ca²⁺浓度立即升高。与传统的单次电刺激相比，激光照射后立即引发了更高频率的脉冲。神经元响应的互相关分析表明，激光照射降低了神经元的同步性。

作者贡献声明

星川千惠：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、监督、资源管理、项目管理、研究、资金获取、数据管理、概念构思。关川由美：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、验证、方法学、研究、数据分析、概念构思。增井京子：撰写 – 审稿与编辑、验证、项目管理。美之岛渡：撰写 – 审稿与编辑、撰写 –

利益冲突声明

? 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：星川千惠报告获得了日本学术振兴会的财务支持。星川千惠报告获得了日本科学技术机构的财务支持。星川千惠报告获得了旭硝子基金会的财务支持。如果有其他作者，他们声明没有已知的财务利益冲突。

致谢

本工作得到了JSPS KAKENHI科研费（项目编号JP22H05140、JP23K18511和JP23H03501）、旭硝子基金会以及JST FOREST计划（项目编号JPMJFR2053）的支持。