一种双重响应荧光探针，可用于同时检测H?S和SO?，并将其应用于神经元细胞的氧化应激模型中

《Bioorganic Chemistry》：A dual-responsive fluorescent probe for simultaneous detection of H 2S and SO 2 and its application in an oxidative stress model of neuronal cells

　　硫化氢与二氧化硫双响应荧光探针RHO-DCO-NBD的构建及其在氧化应激相关神经退行性疾病中的检测应用。该探针通过NBD单元特异性捕获H2S并释放近红外荧光（760 nm），同时利用二噁噻酮单元对SO2产生电子转移效应发出可见光（590 nm），实现了两种气体分子的高灵敏度（2.7 nM和2.0 nM）选择性检测，并成功应用于PC12细胞氧化应激模型的双气体动态监测。

　　
该研究聚焦于开发一种新型双响应荧光探针RHO-DCO-NBD，旨在突破硫化氢（H?S）与二氧化硫（SO?）检测中信号干扰的难题。研究团队通过整合化学生物学策略，构建了包含罗丹明衍生物骨架、硝基苯二氧唑（NBD）单元和二氰oisofuran酮单元的三部分复合结构，成功实现了对两种气体分子的选择性识别与独立信号输出。

在分子设计层面，探针采用"供体-受体"协同机制。罗丹明作为荧光基团，其开环状态负责发射近红外（NIR）荧光信号，而NBD和二氰isosfuran酮单元则分别作为H?S和SO?的特异性捕获位点。当探针遇到H?S时，巯基与NBD单元发生反应性断裂，促使罗丹明骨架恢复开环结构，从而在760 nm处产生特征性荧光增强。对于SO?，其强吸电子特性与探针中的π共轭系统发生电子转移反应，导致荧光基团结构重组，在590 nm处呈现绿色荧光。这种双通道检测机制不仅避免了传统探针因激发光谱重叠导致的信号串扰，更实现了两种气体分子在亚细胞层面的同步可视化。

实验验证部分展示了该探针在复杂生物环境中的优异性能。通过PC12神经元细胞模型，研究证实探针能够有效区分内源性及外源性气体分子的动态变化。在脂多糖（LPS）诱导的氧化应激模型中，探针成功捕捉到H?S和SO?浓度波动的相位差与协同效应。特别值得注意的是，当两种气体分子共存的实验体系中，探针仍能保持独立的荧光响应曲线，这得益于其分子结构中NBD单元与二氰isosfuran酮单元的空间隔离设计。

性能参数测试显示，该探针对H?S的检测限达到2.7 nM，检测范围覆盖0.1-100 μM浓度区间，线性响应关系良好。对于SO?的检测灵敏度更优，2.0 nM的检测限与0.5-50 μM的线性范围充分满足细胞内环境检测需求。荧光信号半衰期测试表明，H?S响应信号可在30分钟内恢复基线，而SO?响应则需要2小时完成信号归零，这种差异化的响应特性为实时监测提供了理论依据。

在应用场景探索方面，研究团队构建了氧化应激与神经退行性疾病关联的检测模型。通过LPS诱导PC12细胞氧化损伤的实验体系，观察到H?S浓度在0-5 μM范围内呈现保护性响应，而SO?浓度超过10 μM时则转为毒性信号。这种剂量依赖性响应曲线为解析气体信号介导的病理机制提供了新的研究工具。特别是在神经元突触区域，探针能够区分线粒体与细胞质中两种气体分子的动态分布，这种空间分辨率优势对于揭示神经炎症机制具有重要价值。

技术对比分析显示，相较于Yin团队开发的CS-ONBD探针，RHO-DCO-NBD在激发波长（480 nm vs 570 nm）和信号通道（NIR vs 绿光）均实现优化，避免了激发光漂移对信号检测的影响。与Dong团队提出的AMN-SSPy探针相比，本研究的探针在复杂生物样本中的抗干扰能力提升显著，经细胞膜穿透实验验证，其生物利用度达到78.2%，显著高于同类探针的45-60%水平。

该研究在方法学层面提出了创新性解决方案：首先采用分阶段荧光激活策略，通过空间位阻设计将NBD与二氰isosfuran酮单元分隔在罗丹明骨架的两侧，避免两种气体分子同时与探针发生反应。其次，引入动态荧光淬灭-恢复机制，当H?S与NBD结合后，探针骨架的刚性结构变化导致淬灭效应解除，荧光恢复时间较传统探针缩短60%。对于SO?检测，开发性的电子转移路径设计使荧光恢复速率达到每分钟0.3个光子单位的恢复速度，这在硫氧化物探针中属于最优水平。

在应用价值方面，该探针为神经退行性疾病研究提供了新的工具。通过建立H?S/SO?双信号动态监测模型，研究揭示了在氧化应激状态下，H?S的神经保护作用与SO?的毒性效应存在时间差（约15分钟）和空间分隔（线粒体与细胞质）。这种双模态检测能力对于解析神经炎症中的气体信号网络调控机制具有重要启示。

研究还特别关注了探针在临床前模型中的普适性。通过跨物种验证（小鼠神经胶质细胞与人类PC12细胞系），发现探针的检测性能保持率超过92%，且在不同培养条件（血清含量、pH值波动范围）下仍能稳定工作。体外模拟胃液环境（pH 1.5-3.5）的稳定性测试表明，探针的荧光信号衰减率控制在5%以内，这为后续开发活体动物成像探针奠定了基础。

在技术局限性方面，研究指出当前探针对溶解氧浓度敏感（阈值＞5%饱和度），未来可通过封装技术改善环境耐受性。此外，在活体成像实验中，需注意激发光对神经细胞突触结构的潜在影响，建议采用双波长激发系统（480 nm和550 nm）以实现选择性激发。

该成果的学术价值体现在三个方面：其一，首次实现H?S/SO?双气体分子在亚细胞层面的实时同步监测，填补了气体信号时空解析的技术空白；其二，开发出基于罗丹明骨架的双响应检测范式，为新型荧光探针设计提供了可复用的分子平台；其三，建立的氧化应激-气体信号网络模型，为解析AD、PD等神经退行性疾病病理机制提供了新的理论框架。

在产业化前景方面，研究团队已开展探针的规模化制备工艺优化，通过连续流合成技术将产率从初始的32%提升至68%，成本降低40%。同时与医疗设备厂商合作开发便携式荧光检测仪，其检测精度达到0.1 nM级别，响应时间缩短至8秒内，已进入临床前诊断设备认证阶段。

该研究对后续工作的启示包括：可尝试将探针与纳米颗粒载体结合，开发靶向递送系统；探索在转基因小鼠模型中的长期监测效果；结合代谢组学技术解析气体信号与生物节律的关联性。这些拓展方向将为构建完整的神经退行性疾病气体信号调控网络提供关键数据支撑。

总体而言，这项研究不仅解决了气体探针设计中的关键科学问题，更在方法学层面推动了生物传感技术的发展。通过创新性的分子设计策略和严谨的实验验证体系，研究团队成功开发出具有临床转化潜力的新型荧光探针，为气体信号在神经退行性疾病中的机制研究提供了可靠的技术平台。