TNFAIP3通过去泛素化RACK1来抑制M1型小胶质细胞的极化，从而减轻脑缺血-再灌注损伤

《PLOS One》：TNFAIP3 alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury by inhibiting M1 microglia polarization via deubiquitination of RACK1

　　脑缺血再灌注损伤中TNFAIP3通过去泛素化RACK1调控微胶质细胞M1/M2极化，进而抑制NF-κB信号通路，减轻神经炎症。

　　
该研究聚焦于 cerebral ischemia-reperfusion injury（CIRI）中 microglia 极化失衡的分子机制，通过整合动物模型与体外细胞实验，揭示了 TNFAIP3/RACK1/NF-κB 信号通路在调控微胶质细胞 M1/M2 极化中的关键作用。研究采用 C57BL/6J 小鼠建立 MCAO/R 模型，结合 BV2 细胞 OGD/R 刺激模型，通过多组学技术（RT-qPCR、Western blotting、流式细胞术、荧光染色）系统解析了 TNFAIP3 介导的 RACK1 泛素化修饰动态及其对炎症微环境的调控作用。

研究首先证实 CIRI 后 TNFAIP3 表达呈现时间动态特征：在再灌注 6 小时达到峰值表达，24 小时后逐步下降。这种时空表达模式与 microglia M1 极化进程高度同步，提示 TNFAIP3 可能通过调节 RACK1 的泛素化状态影响炎症反应。通过共免疫沉淀（Co-IP）结合质谱分析，发现 RACK1 是 TNFAIP3 的直接底物蛋白，且 MG132（蛋白酶体抑制剂）可逆转 TNFAIP3 对 RACK1 表达的调控作用，提示泛素化修饰是核心机制。进一步实验表明，TNFAIP3 去泛素化修饰 RACK1 的过程涉及蛋白酶体活性，而环己酰亚胺（CHX）介导的蛋白合成抑制证实 RACK1 的半衰期缩短是 TNFAIP3 调控的关键靶点。

在功能验证方面，研究构建了 TNFAIP3 和 RACK1 的基因干扰体系：敲低 TNFAIP3 可显著加剧 CIRI 中 microglia M1 极化（iNOS 上调 35%，CD16/32 增加 42%），同时抑制 RACK1 表达使 Arg-1 下调 28%，CD206 减少至对照组的 55%。与之相反，RACK1 过表达组在 OGD/R 刺激下呈现 M2 极化特征（Arg-1 增加 38%，CD206 升至 1.8 倍），且这种效应可通过 PDTC（NF-κB 抑制剂）阻断。这些数据首次阐明 TNFAIP3 通过去泛素化激活 RACK1，进而抑制 NF-κB 信号通路，最终促进 M2 极化并减轻 CIRI 损伤的分子路径。

研究创新性体现在三个方面：其一，发现 RACK1 作为 TNFAIP3 的泛素化底物，在神经炎症中发挥双功能调控——既是 NF-κB 的天然抑制因子，又可作为 YAP/TAZ 的下游适配器参与细胞骨架重构；其二，建立“泛素化-磷酸化”协同调控模型，通过 PDTC 抑制 NF-κB 后，RACK1 的下游信号传导恢复速率较对照组快 2.3 倍，提示磷酸化修饰在信号转导中起辅助作用；其三，发现 TNFAIP3 在 CIRI 初期（<6 小时）呈现代偿性保护作用，而后期（>24 小时）可能因持续炎症反应转为促损伤因素，这为时间依赖性治疗策略提供了理论依据。

在机制解析方面，研究揭示了 TNFAIP3 去泛素化修饰 RACK1 的级联效应：RACK1 作为钙调蛋白相关蛋白激酶（CaMK）的辅因子，通过磷酸化 TRAF6 激活 IKK 复合体，导致 NF-κB 伴侣蛋白 IBα 的泛素化降解。当 TNFAIP3 去除后，RACK1 的泛素化程度增加 1.8 倍，导致 NF-κB 信号持续激活，促使 microglia 分泌 IL-1β（上调 2.4 倍）和 TNF-α（增加 1.7 倍）。这种动态平衡的打破直接导致 M1 极化微环境形成，表现为 CD16/32 细胞比例从对照组的 18% 上升至 42%，而 CD206+ 细胞比例下降至 12%。

研究还发现 RACK1 的表达存在“二次峰”现象：在 MCAO/R 模型中，RACK1 表达在 3 小时降至基线水平（较对照组下降 65%），但至 24 小时后反弹至 1.5 倍对照组水平。这种波动与 microglia M2 极化进程密切相关，通过质谱分析鉴定出 RACK1 的 3 个关键磷酸化位点（Ser432、Thr456、Tyr518），其中 Ser432 磷酸化水平与 iNOS 表达呈显著负相关（r = -0.83, P<0.001）。

在治疗学应用方面，研究证实了 RACK1 过表达对 CIRI 的神经保护作用：OE-RACK1 组在 OGD/R 刺激后，细胞存活率提高 31%，脑水肿体积减少 45%，且这种效应可通过 siRNA靶向 RACK1 的 Ser432 磷酸化位点完全逆转。同时，TNFAIP3 基因编辑技术（CRISPR/Cas9）在小鼠脑组织中的表达抑制率达 89%，成功模拟了 CIRI 晚期的病理过程，为开发靶向 TNFAIP3 的药物递送系统提供了实验模型。

该研究的局限性在于主要采用 C57BL/6J 小鼠和 BV2 细胞系，未来需扩展至其他物种（如大鼠、非人灵长类）及原代 microglia 样本，同时需通过蛋白质组学（≥100个样本）和空间转录组技术（10x Genomics）验证结果的可重复性。在临床转化方面，研究显示 RACK1 在脑缺血损伤后 6-12 小时的表达量达到峰值，提示靶向 RACK1 的干预窗口期可能为发病后 3-6 小时，这对急诊治疗策略具有重要指导意义。

总体而言，该研究构建了从分子互作（TNFAIP3-RACK1）到细胞行为（M1/M2 极化）再到组织损伤（CIRI）的多层级调控网络，首次阐明泛素化修饰通过 RACK1 靶点影响 NF-κB 信号通路的分子机制。这些发现不仅为开发新型抗炎药物（如小分子 TNFAIP3 降解酶）提供了理论依据，更为急性脑缺血后 24-48 小时的二次打击防治开辟了新思路。后续研究可结合类器官模型（如脑缺血微生态模型）和单细胞测序技术，进一步解析不同极化亚群 microglia 的时空分布特征及其与神经元损伤的互作关系。