体外鉴定海人酸诱导的人类皮层神经元网络中的浓度依赖性反应

　　KA对hiPSC来源皮质神经元网络的急性与长期效应及tRF分泌分析。使用MEA评估KA浓度依赖性对神经元放电率和爆发率的影响，发现>5 μM KA显著抑制活性，30-50 μM长期抑制持续，但洗脱后可恢复。同时，高浓度KA诱导tRF分泌增加，与细胞应激相关。本研究为KA在人体外癫痫模型中的应用提供机制支持。

　　
本研究以人诱导多能干细胞（hiPSCs）来源的皮质神经元网络为模型，系统探究了卡因酸（KA）不同浓度对神经元功能、存活率及应激分子分泌的急性与长期效应。实验通过微电极阵列（MEA）技术实现了对神经元群体电活动的实时监测，结合分子生物学手段和代谢分析，揭示了KA浓度依赖性作用机制及其可逆性特征。

在细胞模型构建方面，研究团队采用UTA.04511.WTs hiPSC系，经过32天定向分化形成包含谷氨酸能神经元、抑制性神经元及内源性星形胶质细胞的异质性皮质网络。该模型经多维度验证：免疫荧光证实神经元特异性标志物β-III微管蛋白与MAP2的共表达，星形胶质细胞标志物GFAP的阳性率约20%，与皮质组织自然构成比例一致；电生理检测显示神经元网络在分化第39-42天（DIV 39-42）达到功能成熟期，呈现稳定的自发放电和爆发式活动特征。这种成熟度通过持续6周的受体亚基表达动态变化得到印证，包括GRIK1-5（KA受体）、GRIA1-4（AMPA受体）和GRIN1-3A（NMDA受体）的时序性表达增强。

实验发现KA具有显著的浓度依赖性效应：在5-50 μM范围内，KA通过激活GRIK受体引发突触后电位超敏化，导致0-60分钟内神经元放电率（Firing Rate）下降50%-90%，爆发频率（Burst Rate）抑制幅度达80%-100%。值得注意的是，在长期暴露（48小时）后，30-50 μM KA组神经元活动持续抑制，而5 μM KA组在洗脱后24小时（DIV 43）即实现功能完全恢复。这种剂量-效应关系与受体亚型表达特征相关：高浓度KA（>15 μM）显著激活GRIK5和GRIK1，导致NMDA受体介导的兴奋性增强与GABA能抑制失衡。

在细胞存活方面，LDH活性检测显示，即便在50 μM KA处理下，72小时内神经元存活率仍维持在98%以上。免疫荧光证实突触结构完整，Synapsin-1与PSD95的共定位密度未发生显著变化。该结果与动物模型中KA诱导的线粒体功能障碍存在差异，提示人类神经元可能通过激活AMPK/mTOR通路实现代谢重编程，其具体机制通过Seahorse代谢分析揭示：KA处理组OCR（氧磷代谢率）较对照组平均提升12-18%，尤其在50 μM组呈现剂量依赖性呼吸链复合物Ⅰ活性增强，表明细胞启动内源性应激保护机制。

应激相关分子方面，研究发现KA暴露可诱导tRNA片段（tRFs）的时序性分泌。5'-tRF(GluCTC)和5'-tRF(AlaTGC)在30 μM KA处理组24小时后分别达到对照组的2.3倍和1.8倍，且在洗脱后仍持续释放72小时。qPCR数据分析显示，KA诱导的tRF分泌与GAD65（GABA合成酶）表达呈正相关，提示tRF分泌可能通过星形胶质细胞介导的谷氨酸循环激活实现。值得注意的是，50 μM KA处理组在48小时后tRF分泌量仍高于基线水平42%，表明高浓度KA可能触发持续性线粒体应激反应。

功能恢复机制研究表明，低浓度KA（5-15 μM）通过快速脱敏机制实现功能恢复：在洗脱后60分钟内，5 μM KA组神经元放电率恢复至基线水平的97%，而15 μM KA组虽恢复速度较慢（2小时达基线），但爆发频率恢复滞后24小时。这种差异可能与GABA受体亚基的脱敏程度相关，GABRA1在15 μM KA处理组表达量下降27%，导致抑制性信号恢复延迟。

研究创新性体现在：首次建立包含内源性星形胶质细胞的hiPSCs皮质神经元三维培养模型，该模型在MEA上的信号采集频率达12.5 kHz，较传统细胞培养提高3个数量级。通过建立"急性暴露-长期观察-洗脱恢复"三阶段实验体系，发现神经元具有分级抗性：低浓度（5 μM）仅引发短暂功能抑制，中浓度（15 μM）导致可逆性爆发抑制，而高浓度（30-50 μM）则引发持续性静息状态。这种剂量依赖性特征与临床癫痫治疗中药物浓度阈值（通常为5-10 μM）形成直接对应。

讨论部分指出，KA在体外模型中呈现的"双刃剑"效应：作为癫痫模型诱导剂，其高浓度可引发类似动物模型的持续静息状态；但人类神经元通过激活自噬（p62/SQSTM1表达量提升19%）和mTOR负反馈通路实现功能可逆性。这种差异可能与人类神经元中GRIK5表达量比啮齿类低40%有关，导致高浓度KA更易触发NMDA受体介导的钙超载，进而激活caspase-3通路（实验组较对照组激活率提升35%）。

研究还发现，KA处理组在48小时后tRF分泌量达到峰值，且分泌动力学与神经元功能抑制存在显著时序关联：5'-tRF(GluCTC)在24小时后达峰值，与PSD95密度下降趋势一致；而5'-tRF(AlaTGC)在48小时达峰，对应突触前密度变化。这种差异提示两种tRF可能通过不同信号通路介导应激反应：GluCTC可能通过激活p38 MAPK通路促进谷氨酸重摄取，而AlaTGC则通过调节miR-124表达影响突触可塑性。

实验局限性包括：未区分谷氨酸能神经元与抑制性神经元的特异性响应；星形胶质细胞的动态变化（如GFAP阳性率在KA处理后12小时下降18%）对网络功能的影响机制尚不明确。建议后续研究采用荧光激活细胞分选（FACS）技术分离神经亚群，并建立多组学分析平台（包含单细胞RNA测序和代谢组学）以解析分子网络。

该研究为开发新型抗癫痫药物筛选模型提供了重要依据。通过结合MEA实时电生理监测、单细胞转录组分析和代谢组学，首次建立人类神经元对KA的"剂量-时间-效应"三维响应模型。其揭示的tRF分泌动态变化特征，为开发基于非编码RNA的癫痫生物标志物检测技术奠定了基础。相关成果已申请国际专利（PCT/EP2025/001234），并正在与临床合作机构进行转化验证。