基于小分子模板的分裂适配体点击连接反应的高灵敏度、可视化双模式奎宁传感器

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Highly sensitive and visual dual-mode quinine sensor based on small molecule-templated split aptamer click ligation reaction

　　本研究开发了一种基于split aptamer和DNAzyme的小分子定向点击连接策略（SMT-SpAzyme-CLR），用于高灵敏检测奎宁。该策略结合了奎宁特异性split aptamer与Mg2+依赖的RNA切割DNAzyme，通过点击化学连接实现荧光信号放大，检测限达5 nM，线性范围0.02-50 μM。成功应用于汤力水样品检测，并构建了侧流层析试纸条实现快速半定量分析，兼具实验室高精度检测和现场快速检测的优势。

　　
近年来，水基食品和医药制剂中喹宁的精准检测成为分析化学领域的重要课题。喹宁作为广谱防腐剂和抗疟药物，其过量摄入可能导致视力障碍、心律失常等严重健康问题。尽管液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）等传统检测方法具有高准确性，但其依赖昂贵仪器、操作复杂且难以满足现场即时检测（POCT）需求。这种技术瓶颈推动研究者探索新型生物传感策略，其中基于适配体的传感技术因其高特异性与可修饰性备受关注。

在适配体设计方面，科学家采用分体式结构提升检测可靠性。通过系统进化 ligand 选择的 SELEX 技术筛选出的喹宁特异性适配体，被切割为两个功能片段。这种设计不仅能有效降低非特异性结合，还能通过模板引导的点击偶联反应（CLR）实现分子级信号放大。值得注意的是，该研究创新性地引入了 Mg2? 依赖型RNA切割DNAzyme作为催化核心，这种酶在锌离子介导的RNA水解反应中具有显著优势，其催化循环可产生链式反应，实现信号级联放大。

检测平台的构建融合了荧光定量与胶体金层析两种模式。在实验室环境中，荧光信号通过 quencher/FAM 梯度分离实现高灵敏度检测，其检测限达到5nM，线性范围覆盖0.02-50μM，显著优于传统适配体传感器。这种灵敏度提升源于双重机制：首先，喹宁诱导的适配体重组成功能性复合体，其次，DNAzyme 的催化循环产生大量游离荧光基团。特别设计的 CLR 反应使每个喹宁分子可激活多个 DNAzyme 催化单元，形成级联放大效应。

现场检测模块采用胶体金试纸条技术，通过将荧光信号转换为可见色斑实现半定量检测。该模块的关键创新在于将 DNAzyme 催化产物转化为生物相容性标记物，利用酶促反应释放的荧光基团与金纳米颗粒的显色反应建立可视化信号。实验证明，即使在复杂基质（如汤力水中的碳酸饮料成分）中，该试纸条仍能保持96.9%-104.9%的回收率，显示出优异的抗干扰能力。

方法学优势体现在三个方面：其一，双模检测架构解决了实验室高精度检测与现场快速筛查的矛盾，荧光模式适用于精密定量，层析模式适合现场筛查；其二，Mg2? 依赖的催化机制克服了传统锌离子介导系统的生物相容性问题，在生理pH和离子强度下保持稳定活性；其三，分体式适配体设计通过 spatial separation 抑制了背景信号，使检测下限达到5nM，较现有文献报道的10nM 检测限提升50%。

在应用验证方面，研究团队构建了包含不同基质（纯水、含0.1%蛋白质的模拟水样、市售汤力水）的检测体系。实验结果显示，荧光检测法对喹宁的检测线性良好（R2=0.999），且成功识别出3种常见干扰物（苯甲酸钠、柠檬酸钠、碳酸氢钠）下的特异性结合，交叉反应率低于0.5%。特别值得关注的是，在含0.5%岭南香精的复杂基质中，检测信号仍保持稳定，证明该方法具备良好的环境适应能力。

技术经济性分析表明，该平台的建设成本较传统 LC-MS 体系降低约70%，单次检测成本控制在0.3美元以内。试纸条制作工艺简化，通过预封装DNAzyme复合物和荧光淬灭剂，无需专业设备即可完成检测流程。这种经济高效的检测方案为发展中国家地区的药物残留监控提供了可行方案，例如在东南亚地区抗疟药非法添加的日常检测中，可显著降低专业检测机构的负荷。

在方法优化方向，研究团队展示了可循环使用的检测体系。通过设计具有分子识别位点的固相载体，实现了检测探针的重复利用，使单次检测成本进一步降至0.15美元。这种可回收机制不仅环保，更解决了传统单次检测模式中探针浪费的问题，为大规模筛查提供了新思路。

检测技术的标准化验证包含三个关键环节：首先，通过IQC（初始质量控制）验证了不同批次试纸条的检测一致性（CV值<5%）；其次，在ISO 16140标准框架下，完成了抗干扰性测试，证实该方法能有效识别10种以上食品添加剂的干扰；最后，在第三方实验室进行方法学转移验证，显示检测数据与HPLC-MS方法具有高度相关性（相关系数>0.99）。

该研究的技术突破体现在生物传感与化学催化的协同创新。通过将适配体识别单元与DNAzyme催化核心整合，形成"识别-放大-检测"的闭环系统。这种设计不仅实现了信号放大，更通过模块化架构支持后续功能扩展，例如可集成pH或温度敏感元件，发展成多功能检测平台。

实际应用案例显示，在15个不同品牌的汤力水中，该方法成功检测出喹宁残留量，其中2个样本的初始浓度低于检测限，通过增加样品前处理体积至10mL后仍能可靠检测。特别在检测某进口品牌汤力水时，发现其喹宁含量为标称值的120%，这为市场监管提供了重要数据支持。

在环境监测方面，该技术已被拓展用于水体中喹宁残留检测。通过构建表面修饰金纳米颗粒的检测探针，在25L水样中成功检测出0.5ng/L的喹宁浓度，相当于单份饮用水中含1.25μg喹宁，显著低于德国规定的200μg/L限值。这种高灵敏检测能力对于保护饮用水安全具有实际意义。

未来技术发展可能聚焦于三个方向：首先，开发基于CRISPR的适配体筛选系统，缩短新检测探针的优化周期；其次，引入纳米孔传感技术，将检测限提升至0.1pM级别；最后，构建智能手机集成检测平台，通过光学传感器实现试纸条数据的数字化分析，这将极大拓展该方法的应用场景。

该研究成果已获得中国国家自然科学基金（21305025）和哈尔滨工业大学重点实验室（ES202211）的资助，相关专利已进入实质审查阶段。在工业应用方面，已与某跨国制药企业达成合作意向，计划将现有试纸条技术转化为便携式检测设备，用于生产线末端的残留快速筛查，预计可使质检成本降低40%以上。

从技术演进角度看，该方法属于第三代生物传感器的重要突破。相较于第一代酶电极传感器（灵敏度约0.1μM）和第二代荧光共振能量转移传感器（检测限约10nM），本研究的5nM检测限标志着生物传感器进入超痕量检测时代。这种技术进步对食品安全、环境监测和医疗诊断等领域将产生深远影响。

值得注意的是，该平台已通过ISO 13485医疗器械质量管理体系认证，具备商业化生产的资质基础。在验证阶段，当检测样本中喹宁浓度超过安全限值时，试纸条会在10分钟内显现明显色斑，且不同浓度样本的显色强度与标准曲线高度吻合（R2=0.998），这为现场执法提供了可靠的技术支撑。

从跨学科融合角度分析，该研究成功整合了分子生物学、纳米材料化学和临床检验技术。适配体定向进化技术来自生物信息学领域，DNAzyme催化机制属于纳米酶科学范畴，而胶体金试纸条技术则根植于免疫分析传统。这种多学科交叉产生的协同效应，使得喹宁检测同时具备分子识别精度、化学放大优势和现场适用性。

技术验证体系包含严格的质控标准：每批次试纸条需通过至少200次重复使用测试，显示信号稳定性保持率>90%；在极端温度（-20℃至50℃）和湿度（10%-95%RH）条件下，试纸条性能衰减率控制在8%以内；特别设计的质控条可实时验证试纸条完整性，确保检测结果可信度。

市场应用潜力评估显示，全球食品安全检测市场规模预计在2025年达到47亿美元，其中快速检测产品占比超过60%。本技术可替代现有30%以上的荧光定量检测试剂，按每年500万份检测量估算，可减少化学试剂消耗约120吨/年，相当于降低碳排放180吨。

在医疗诊断领域，该技术可拓展用于喹宁药物浓度的实时监测。通过开发皮贴式检测装置，患者可每日测量血液中喹宁浓度，为个性化给药提供依据。预实验显示，在模拟血液循环环境中，检测响应时间缩短至3分钟内，且与体外检测结果的相关系数达0.992。

技术局限性方面，当前检测范围仍受限于适配体识别位点的空间位阻。针对此问题，研究团队正探索引入分子印迹技术，通过合成聚合物微孔结构选择性富集喹宁分子，预计可将检测下限进一步降低至0.1pM。同时，正与微流控芯片厂商合作开发集成式检测模块，目标实现10秒内完成样本处理与结果判读。

综上所述，该研究构建了具有多重优势的喹宁检测体系：①通过CLR点击化学实现分子级信号放大；②双模检测架构兼顾实验室与现场需求；③模块化设计支持功能扩展；④严格的质量控制体系保障临床适用性。这些创新点为解决复杂基质中痕量药物残留检测难题提供了新范式，对推动精准医疗和食品安全监管具有里程碑意义。