《Brain Research》：DDX3X promotes ILF3 stability to accelerate neuroblastoma progression via M2 macrophage polarization
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神经母细胞瘤（NB）中DDX3X通过稳定ILF3 mRNA促进M2型巨噬细胞极化，加速肿瘤进展和转移。通过基因敲除和过表达验证轴的调控作用，发现DDX3X抑制剂RK-33可抑制NB生长并增强M1极化，而ILF3过表达部分逆转该效应。
天林|陈星和|黄赫|张建星|林俊山
福建医科大学附属第一医院小儿外科，中国福州350005
摘要
神经母细胞瘤（NB）是一种常见的儿童实体瘤，预后较差，越来越多的研究表明巨噬细胞极化是疾病进展的关键驱动因素。然而，RNA结合蛋白如DEAD-box解旋酶3 X连锁（DDX3X）和白细胞介素增强因子3（ILF3）在此过程中的作用仍不清楚。本研究旨在探讨DDX3X–ILF3轴在调节巨噬细胞极化及促进NB恶性进展中的作用。通过RT-qPCR和Western blotting检测ILF3的表达。分别使用慢病毒介导的方法敲低ILF3或DDX3X，然后评估细胞的存活率、增殖能力、侵袭性和迁移性。在Transwell共培养系统中，通过Western blotting检测极化标志物的表达，并通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）测量炎症因子的分泌情况。使用放线菌素D处理结合RT-qPCR来评估ILF3 mRNA的稳定性。通过RIP-qPCR研究DDX3X与ILF3 mRNA的相互作用。建立NB异种移植和转移小鼠模型（肺、肝、肾），以评估DDX3X抑制剂RK-33和ILF3过表达对NB生长和转移的调控作用。结果显示，NB细胞中ILF3的表达显著上调。敲低ILF3或DDX3X可抑制NB细胞的存活率、增殖能力、侵袭性和迁移性，同时促进M1型巨噬细胞的极化并增加炎症因子的分泌。沉默DDX3X可降低ILF3 mRNA的稳定性和蛋白质表达，而ILF3过表达则抵消了DDX3X敲低对恶性行为和极化状态的抑制作用。在体内实验中，DDX3X抑制剂RK-33显著抑制NB肿瘤的生长和转移，并增强M1型巨噬细胞的极化，这种效应部分被ILF3过表达所逆转。DDX3X通过稳定ILF3 mRNA来促进NB的进展，从而促进M2型巨噬细胞的极化。
引言
神经母细胞瘤（NB）是婴儿中常见的颅外实体瘤，约占儿童癌症相关死亡的15%（Zafar等人，2021年）。尽管包括手术、化疗、放疗和免疫疗法在内的多种治疗方法有所进展，但由于NB具有高转移率，其预后仍然较差（Chung等人，2021年）。越来越多的证据表明，肿瘤微环境（TME），特别是巨噬细胞等免疫细胞，对NB的进展至关重要（Blavier等人，2020年）。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）具有显著的可塑性，可以极化为具有抗肿瘤作用的M1表型或促进肿瘤生长、血管生成和免疫逃逸的M2表型（Gao等人，2022年）。因此，增强M1型巨噬细胞极化的策略可能是对抗肿瘤进展和改善NB治疗结果的有效方法。
白细胞介素增强因子3（ILF3）是一种双链RNA结合蛋白，参与多种细胞过程，包括RNA稳定性、转录和翻译（Xu等人，2020年）。ILF3的异常表达与多种癌症的进展有关，包括胶质母细胞瘤（Bi等人，2021年）和肝细胞癌（Qiu等人，2023年），尽管其在NB和巨噬细胞极化中的作用尚不清楚。此外，DEAD-box解旋酶3 X连锁（DDX3X）是一种ATP依赖的RNA解旋酶，参与RNA代谢、先天免疫和癌症生物学（von Mueffling等人，2024年）。研究表明，DDX3X可调节特定目标RNA的稳定性和翻译，这凸显了其在癌症发展和进展中的关键作用（Chan等人，2019年）。然而，DDX3X与ILF3之间的调控关系以及它们对NB TME中巨噬细胞极化的共同影响尚未阐明。
在本研究中，我们假设DDX3X可能通过稳定ILF3 mRNA来促进NB的进展，从而促进M2型巨噬细胞的极化。基于这一假设，我们研究了DDX3X–ILF3轴在NB细胞中的功能作用及其对巨噬细胞极化的影响。我们的发现旨在提供新的机制，以解释NB的进展机制，并确定潜在的治疗靶点，以重塑TME，从而有利于抗肿瘤免疫。
细胞处理
人正常神经干细胞（hNSCs，BFN607200471）来自中国上海的青奇公司。NB细胞系（SK-N-SH（CL-0214）、SK-N-AS（CL-0621）、IMR-32（CL-0124）和SK-N-BE（CL-0441）来自中国武汉的Procell公司。细胞在含有5% CO2的湿润环境中于37°C下培养，使用含有10%胎牛血清（FBS，164210–50，Procell）和1%青霉素-链霉素（PB180120，Procell）的最低必需培养基（MEM，PM150410，Procell）进行培养。
ILF3可能是NB发展的驱动因素
为了研究ILF3在NB中的潜在作用，我们分析了hNSCs和几种NB细胞系中的ILF3表达。RT-qPCR分析显示，SK-N-SH、SK-N-AS、IMR-32和SK-N-BE细胞中的ILF3 mRNA水平显著上调（图1A）。Western blotting进一步证实了这一上调现象，结果显示NB细胞中的ILF3蛋白表达显著高于hNSCs（图1B）。这些发现表明，ILF3在NB中表达异常上调。
讨论
TAMs与NB的不良临床预后相关，其中M2极化的巨噬细胞亚群通过促进肿瘤转移、形成免疫抑制微环境以及增强对放疗和免疫检查点阻断的抵抗力而特别有害（Liu和Joshi，2020年）。本研究证明，ILF3通过驱动M2表型巨噬细胞的极化来促进NB细胞的恶性行为，进一步支持了TAMs在NB中的促肿瘤作用。
伦理声明
动物实验获得了湖南基于证据的生物技术有限公司机构动物护理和使用委员会的批准（批准编号：20250617），并遵循3Rs原则进行。
CRediT作者贡献声明
天林：撰写初稿、研究设计、概念构思。陈星和：数据分析、数据管理。黄赫：数据可视化、实验监督。张建星：结果验证、方法学设计。林俊山：撰写修订、软件使用、方法学实施。
资助
本研究得到了福建医科大学科研启动基金（编号：2020QH1029）的支持。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
