p53基因武装溶瘤腺病毒通过巨胞饮途径诱导胰腺癌相关星状细胞凋亡的研究

《Cancer Gene Therapy》：p53-armed oncolytic adenovirus induces apoptosis in pancreatic cancer-associated stellate cells via macropinocytosis

　　本研究针对胰腺导管腺癌(PDAC)基质微环境中胰腺星状细胞(PSCs)促进肿瘤进展的难题，探讨了p53基因武装溶瘤腺病毒OBP-702通过巨胞饮(macropinocytosis)途径增强病毒进入并诱导PSCs凋亡的新机制。研究人员发现PDAC激活的PSCs通过巨胞饮途径显著提高对溶瘤腺病毒的敏感性，OBP-702通过p53介导的凋亡通路有效清除肿瘤基质细胞，为PDAC基质靶向治疗提供了新策略。

　　

胰腺癌被称为"癌中之王"，胰腺导管腺癌(PDAC)更是以其极高的死亡率令人闻之色变。尽管近年来外科手术、多药联合化疗、放疗和分子靶向治疗取得了长足进步，但PDAC患者的5年相对生存率仍然低于10%。这一残酷现实的背后，是PDAC独特的肿瘤微环境(TME)在作祟——特别是由大量纤维化基质组成的沙漠般贫瘠的环境，这些基质不仅为肿瘤细胞提供"保护伞"，还积极参与化疗耐药、免疫逃逸和肿瘤进展的恶性进程。

在这场肿瘤与基质的"共谋"中，胰腺星状细胞(PSCs)扮演着关键角色。当PDAC细胞通过分泌各种细胞因子、生长因子和代谢产物激活PSCs后，这些原本静息的细胞就转变为癌症相关成纤维细胞(CAFs)，成为肿瘤基质的最大组成部分。更令人惊讶的是，PDAC肿瘤还展现出一种特殊的"进食"能力——巨胞饮(macropinocytosis)，通过这种细胞吞噬作用，肿瘤细胞能够从贫瘠的环境中摄取营养颗粒，甚至是病毒颗粒。这种适应性的代谢机制为肿瘤在缺氧、营养缺乏的恶劣环境中生存提供了可能。

日本冈山大学的研究团队长期致力于溶瘤病毒疗法的开发，他们先前研发的端粒酶特异性溶瘤腺病毒OBP-301及其p53基因武装版本OBP-702，已在多种肿瘤治疗中展现出潜力。然而，这些病毒能否突破PDAC的基质屏障，特别是能否有效靶向肿瘤相关的PSCs，仍然是一个未解之谜。研究人员假设，PDAC激活的PSCs可能通过增强的巨胞饮作用提高对溶瘤腺病毒的敏感性，而p53基因的导入可能进一步诱导这些基质细胞的凋亡，从而瓦解肿瘤的"保护伞"。

为验证这一假设，研究团队开展了一系列精巧的实验。他们首先利用Panc-1和BxPC-3两种人PDAC细胞的条件培养基(CM)激活人PSCs，模拟肿瘤微环境中的PSCs活化状态。通过病毒敏感性分析、巨胞饮抑制实验、蛋白质印迹和实时PCR等技术，系统评估了病毒进入、复制和细胞病变效应。此外，还建立了三维(3D)共培养模型和体内异种移植肿瘤模型，模拟PDAC肿瘤的复杂微环境，验证病毒的 therapeutic 效果。

主要技术方法

研究采用人PDAC细胞系(Panc-1、BxPC-3)和原代人PSCs细胞系(hPSC-5、hPSC-14)进行体外实验。通过条件培养基模拟肿瘤微环境对PSCs的激活，使用巨胞饮抑制剂EIPA评估病毒进入机制。病毒敏感性通过XTT法检测细胞活力，蛋白质印迹分析病毒E1A蛋白和凋亡标志物PARP剪切。建立3D共培养模型模拟PDAC基质环境，并利用BALB/c裸鼠异种移植模型进行体内疗效评价。

病毒敏感性增强与巨胞饮激活

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研究人员发现，PDAC条件培养基激活的PSCs对野生型腺病毒Ad5的敏感性显著增强。病毒感染96小时后，PDAC-CM孵育的hPSC-5细胞出现明显的形态学改变，细胞变圆脱落，且细胞活力显著降低。Western blot分析显示病毒E1A蛋白表达增加，实时PCR检测发现病毒E1A DNA拷贝数升高，表明病毒进入和早期复制增强。使用表达绿色荧光蛋白(GFP)的复制缺陷型腺病毒Ad-GFP进一步证实，PDAC激活的PSCs中GFP积累显著增加，提示病毒进入效率提高。

巨胞饮介导的病毒进入机制

为探究病毒敏感性增强的机制，研究人员评估了巨胞饮的作用。使用四甲基罗丹明(TMR)标记的葡聚糖进行巨胞饮检测，发现PDAC激活的PSCs中葡聚糖摄取显著增加。当使用巨胞饮特异性抑制剂EIPA处理细胞后，病毒E1A DNA拷贝数和GFP表达均显著降低，证实巨胞饮是介导病毒进入的重要途径。有趣的是，流式细胞术分析显示腺病毒受体CAR和整合素αvβ3、αvβ5的表达并未增加，表明这种病毒敏感性增强是受体非依赖性的。

溶瘤腺病毒的 therapeutic 潜力

研究人员进一步评估了端粒酶特异性溶瘤腺病毒OBP-301及其p53基因武装版本OBP-702对PDAC激活PSCs的 therapeutic 效果。XTT实验显示，OBP-702在中等和高感染复数(MOI)下能显著降低Panc-1-CM和BxPC-3-CM激活的PSCs活力，而OBP-301仅在高MOI下对BxPC-3-CM激活的PSCs有效。Western blot分析证实，OBP-702感染后，PSCs中病毒E1A蛋白、p53蛋白表达增加，并伴随PARP蛋白的剪切，表明p53介导的凋亡通路被激活。

三维培养模型中的验证

为模拟体内PDAC肿瘤的复杂微环境，研究团队建立了PDAC细胞与PSCs的3D共培养模型。免疫荧光染色显示，OBP-702处理能显著减小细胞角蛋白阳性(cytokeratin-positive)的PDAC肿瘤巢大小，同时增加p53在细胞角蛋白阴性的基质细胞中的表达。TUNEL凋亡检测进一步证实，OBP-702能诱导PDAC细胞和PSCs发生凋亡，而OBP-301的效应较弱。

体内抗肿瘤效果

在BxPC-3和hPSC-14细胞共移植的裸鼠模型中，PSCs的加入显著促进了肿瘤生长。瘤内注射OBP-301或OBP-702均能抑制肿瘤生长，但OBP-702的效果显著优于OBP-301。免疫组化分析显示，OBP-702处理组肿瘤基质区域p53表达显著增加，表明病毒成功感染并作用于基质细胞。腺病毒hexon蛋白染色证实OBP-702能在肿瘤基质中有效分布。

研究结论与意义

本研究揭示了PDAC激活的胰腺星状细胞通过巨胞饮途径增强对溶瘤腺病毒敏感性的新机制。p53基因武装的溶瘤腺病毒OBP-702能通过双重作用机制——巨胞饮介导的病毒进入增强和p53介导的凋亡诱导，有效清除PDAC肿瘤细胞和肿瘤相关基质细胞。这一发现为克服PDAC基质屏障提供了新思路，溶瘤病毒疗法与免疫检查点抑制剂的联合应用可能成为PDAC治疗的新策略。

该研究的创新点在于首次系统阐明了巨胞饮在溶瘤病毒靶向肿瘤基质中的作用，并证实了p53激活在清除癌症相关成纤维细胞中的 therapeutic 价值。这些发现不仅为PDAC治疗提供了新的候选方案，也为其他富含基质的实体瘤治疗提供了借鉴。随着溶瘤病毒技术的不断成熟和联合治疗策略的优化，这种针对肿瘤微环境的精准打击策略有望为胰腺癌患者带来新的希望。