尼帕病毒附着糖蛋白抗原图谱解析揭示跨物种保护性免疫优势表位

《npj Vaccines》：Antigenic landscape of Nipah virus attachment glycoprotein analysis reveals a protective immunodominant epitope across species

　　本研究针对高致病性亨尼帕病毒（HNVs）缺乏临床批准疫苗和特效疗法的难题，系统解析了尼帕病毒（NiV）附着糖蛋白（G）的抗原图谱。研究人员通过纳米颗粒疫苗免疫小鼠获得27株单克隆抗体（mAbs），发现其中25株能有效中和NiV，5株可交叉中和亨德拉病毒（HeV）。结构生物学揭示了G蛋白上四个非重叠表位，包括两个新型抗原位点和一个跨物种保守的“公共”保护性表位。该研究阐明了抗体通过阻断受体结合或膜融合的不同中和机制，并证实代表性抗体在仓鼠模型中能提供完全保护，为抗病毒抗体药物和理性疫苗设计提供了新见解。

　　

在病毒的世界里，亨尼帕病毒（Henipaviruses, HNVs）家族中的尼帕病毒（Nipah virus, NiV）和亨德拉病毒（Hendra virus, HeV）堪称“致命杀手”。它们能引起人类严重的脑炎和呼吸道疾病，死亡率高达50%-100%。自20世纪90年代首次被发现以来，尼帕病毒在孟加拉国和印度等地反复爆发，而亨德拉病毒在澳大利亚也时有发生，主要通过蝙蝠、猪、马等动物传染给人类，对全球公共卫生构成持续威胁。然而，尽管其危险性如此之高，迄今为止临床上仍缺乏针对亨尼帕病毒的有效疫苗或特异性治疗方法，这成为了摆在科学家面前的一道紧迫难题。

病毒要入侵细胞，需要借助其表面的“钥匙”来打开宿主细胞的“锁”。对于尼帕病毒而言，这把“钥匙”就是其表面的附着糖蛋白（G蛋白）。G蛋白能够识别并结合宿主细胞表面的受体（如ephrin-B2和ephrin-B3），如同钥匙插入锁孔，进而触发另一个融合蛋白（F蛋白）介导病毒与细胞膜的融合，从而开启病毒感染的第一步。正因为G蛋白在病毒入侵过程中扮演着如此关键的角色，它自然成为了开发疫苗和抗体药物的理想靶点。虽然此前已有一些针对G蛋白的抗体被报道，但大多数通过阻断受体结合位点来发挥作用，我们对于G蛋白上究竟有哪些“命门”（即抗原表位）可以被抗体攻击，以及这些抗体如何精确地中和病毒，认知仍然非常有限。

为了解决这一难题，由武汉大学、中国科学院武汉病毒研究所和中国科学技术大学等单位的研究人员组成的团队开展了一项深入的研究。他们的研究成果发表在《npj Vaccines》上，论文标题为“Antigenic landscape of Nipah virus attachment glycoprotein analysis reveals a protective immunodominant epitope across species”。该研究系统性地绘制了尼帕病毒G蛋白的抗原图谱，并揭示了一个具有跨物种保护潜力的免疫优势表位。

为了开展这项研究，研究人员运用了多种关键技术。他们使用基于铁蛋白（ferritin）的NiV G头球区（G^H）纳米颗粒免疫小鼠，从而获得了一系列单克隆抗体（mAbs）。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）评估了这些抗体与不同亨尼帕病毒G蛋白的结合能力。病毒中和实验则分别使用了基于水疱性口炎病毒（VSV）的假病毒系统和真实的尼帕病毒（NiV-Malaysia, NiV-Bangladesh）和亨德拉病毒（HeV）来评估抗体的中和效能。为了探究抗体的作用机制，研究人员采用了生物层干涉技术（BLI）和流式细胞术来检测抗体是否竞争性抑制病毒G蛋白与宿主受体ephrin-B2的结合，并利用双分裂蛋白（DSP）细胞-细胞融合实验来评估抗体对病毒膜融合过程的抑制作用。研究的核心部分依赖于结构生物学方法：通过单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）和X射线晶体学，解析了代表性抗体Fab片段与NiV G^H形成的复合物三维结构，从而在原子水平上阐明了抗体的结合表位。最后，研究在叙利亚金黄仓鼠模型中进行了体内保护效力评估，检验了代表性抗体在暴露前预防和暴露后治疗两种场景下对抗致死性尼帕病毒攻击的效果。

结果

大多数抗NiV G mAbs是NiV的有效中和剂

研究人员此前通过纳米颗粒疫苗免疫获得了27株能与NiV G结合的mAbs。本研究进一步发现，其中25株mAbs能有效中和两种主要的NiV毒株（NiV_M和NiV_B）的假病毒和真实病毒，且大部分效力极高。更有5株mAbs还能交叉中和HeV的感染。与之前报道的几种对照抗体相比，本研究获得的许多mAbs显示出更低的中和半数抑制浓度（IC₅₀），表明纳米颗粒疫苗能有效激发机体产生强效的中和抗体。

第2、3、4组中和mAbs通过不同机制阻断受体结合

病毒中和抗体可以通过阻断病毒与受体的结合来发挥作用。通过竞争结合实验，研究发现第3组mAbs能完全阻止受体ephrin-B2与重组G^H蛋白的结合。而第2组和第4组的mAbs虽然不能直接阻断可溶性G^H与受体的结合，但当G蛋白全长表达在细胞表面（更接近病毒表面的自然状态）时，这些抗体的结合会产生空间位阻，部分干扰了受体的结合。第1组mAbs则不影响受体结合。

第1组和第5组中和mAbs抑制病毒融合

除了阻止病毒附着，抗体还可以抑制病毒与细胞的融合。通过细胞-细胞融合实验，研究发现第1组和第4组的mAbs能有效抑制由NiV G和F蛋白介导的细胞融合。特别值得注意的是，一个之前已知的第5组抗体HENV-32也显示出强大的融合抑制活性，但它并不影响受体结合。而主要作用于受体结合的第3组mAbs，其融合抑制能力反而较弱。这表明不同组的抗体通过截然不同的机制来中和病毒。

强效中和mAbs在体内对致死性NiV感染显示出保护作用

研究的最终目的是评估这些抗体能否在活体动物中提供保护。在仓鼠模型中，研究人员测试了来自各组代表性抗体的保护效果。在暴露前预防性给药中，第3组抗体LN1F9和第4组抗体LN1D11均能提供100%的保护，所有动物存活且无体重下降。而第1组和第2组的抗体则提供部分保护。在更具挑战性的暴露后治疗性给药中，第3组抗体LN1F9依然能提供100%的保护，第4组抗体LN1D11也能提供83%的保护。这证明这些抗体，特别是靶向特定表位的抗体，具有成为预防和治疗药物的巨大潜力。

抗NiV G mAbs识别G上的四个不同抗原位点

为了从分子层面理解抗体如何发挥作用，研究人员解析了代表性抗体与NiV G^H的复合物结构。冷冻电镜结构揭示了第1组（S1E2）、第2组（S2B10）和第4组（LN3D3）抗体的Fab片段可以同时结合在G蛋白上，互不干扰。X射线晶体学则解析了第3组抗体LN1F9与G^H的复合物结构。将这四种结构进行比对，发现它们确实结合在G蛋白β-螺旋桨结构域上四个完全不同的位置：S1E2结合在侧面，S2B10结合在顶部，LN1F9结合在顶部靠近受体结合区域，而LN3D3结合在底部。

第1组和第2组mAbs靶向NiV G上的两个新表位

通过将本研究发现的新表位与已知的受体ephrin-B2结合位点以及其他已报道的抗体结合位点进行比较，研究确认第1组抗体S1E2和第2组抗体S2B10所靶向的是两个前所未有的新型抗原表位。这显著扩展了我们对G蛋白脆弱位点的认知。

第3组mAbs与人和猕猴mAbs共享表位

研究发现，第3组抗体LN1F9结合的表位与之前从HeV G疫苗接种者或感染幸存者中分离出的几个人源抗体、以及从免疫猕猴中分离的抗体所识别的表位高度重叠。这个表位正好是受体ephrin-B2结合的关键区域，因此这些抗体能通过模拟受体或直接竞争来高效阻断病毒入侵。该表位在NiV和HeV之间高度保守，这解释了为什么靶向此处的抗体往往具有交叉中和活性。这表明该区域是一个在不同物种（小鼠、人、猕猴）中都能被免疫系统频繁识别的“公共”免疫优势表位。

受体结合位点（第3组mAbs靶向）是小鼠和仓鼠中的免疫优势抗原位点

通过血清竞争ELISA实验，研究人员分析了经NiV G疫苗免疫的小鼠和仓鼠血清中的抗体组成。结果表明，无论是可溶性G蛋白还是G-铁蛋白纳米颗粒疫苗，都能在小鼠和仓鼠中诱导出针对多个表位（包括第1-4组）的多克隆抗体反应。其中，针对第3组表位（即受体结合区）的抗体反应在免疫动物血清中占主导地位，进一步证实了该区域是一个免疫优势位点。

讨论

本研究通过系统的功能性和结构生物学分析，详细描绘了尼帕病毒附着糖蛋白（G）的抗原图谱。研究不仅证实了已知的受体结合区是一个重要的靶点，更重要的是发现了两个新的抗原表位，分别位于G蛋白β-螺旋桨结构域的侧面（第1组）和顶部（第2组）。这些新表位的发现为设计针对不同机制的抗体鸡尾酒疗法或覆盖更广表位的疫苗提供了新的可能性。

研究阐明了抗体中和病毒的多种机制：直接竞争受体结合（第3组）、通过空间位阻间接影响受体结合（第2、4组）、以及抑制病毒与细胞的融合过程（第1、4、5组）。这种机制的多样性意味着联合使用针对不同表位的抗体可能产生协同效应，并降低病毒逃逸突变的风险。

尤为重要的是，研究在动物模型中验证了代表性抗体的保护效力。第3组抗体LN1F9和第4组抗体LN1D11在暴露前和暴露后给药均表现出极强的保护效果，展示了其作为预防性和治疗性药物的应用前景。第3组抗体所靶向的表位被证实是一个跨物种保守的“公共”表位，这提示针对该表位设计的疫苗或抗体可能具有广谱保护的潜力。

总之，这项研究极大地增进了我们对尼帕病毒G蛋白免疫原性的理解，所鉴定的强效中和抗体和揭示的抗原图谱为开发针对亨尼帕病毒的有效抗体药物和下一代疫苗奠定了坚实的基础，对于应对未来可能出现的亨尼帕病毒疫情具有重要意义。该研究成果凸显了基于结构的疫苗设计（Structure-based vaccine design）和理性抗体筛选在应对新发传染病方面的巨大价值。