基于蛋白质组学分析7-辛烯酸通过调控TGF-β1/SMAD3信号轴和黏着斑通路抑制肝星状细胞活化的抗纤维化机制研究

《Scientific Reports》：Proteomic analysis of 7-octenoic acid antifibrotic effects in TGF-β1 activated hepatic stellate cells

　　本研究针对肝纤维化治疗药物匮乏的临床难题，探讨了辣木活性成分7-辛烯酸(7-OCT)的抗纤维化机制。研究人员通过蛋白质组学分析发现，7-OCT可显著抑制TGF-β1激活的肝星状细胞中α-SMA、胶原蛋白I和MMP-9的表达，其作用机制涉及下调TGFBR1表达、抑制SMAD3磷酸化，并调控黏着斑通路关键蛋白（VTN/ILK/CAV1）。该研究为天然产物抗肝纤维化药物研发提供了新候选化合物和理论依据。

　　

在全球范围内，肝纤维化作为慢性肝病发展的核心环节，正逐渐成为严重的公共卫生问题。当肝脏长期遭受病毒性肝炎、酒精性或非酒精性脂肪性肝炎等损伤因素刺激时，肝星状细胞(Hepatic Stellate Cells, HSCs)会被激活，转化为肌成纤维细胞，过量产生细胞外基质(Extracellular Matrix, ECM)，最终导致肝脏结构和功能的破坏。尽管肝纤维化早期具有可逆性特征，但若不加以控制，将进展为肝硬化甚至肝细胞癌。令人遗憾的是，目前临床上获批的抗肝纤维化药物极为有限，2024年FDA仅批准了Resmetirom（商品名Rezdiffra）用于治疗非酒精性脂肪性肝炎相关的肝纤维化。因此，从天然产物中寻找高效低毒的抗肝纤维化先导化合物，已成为当前药物研发的重要方向。

在这项发表于《Scientific Reports》的研究中，泰国那黎宣大学Kanchana Usuwanthim团队将目光投向了具有悠久药用历史的辣木(Moringa oleifera Lam.)。前期研究发现，从辣木叶中分离得到的7-辛烯酸(7-Octenoic Acid, 7-OCT)对三阴性乳腺癌细胞显示出显著抗癌活性，但其在肝纤维化中的作用尚未可知。本研究首次系统探讨了7-OCT在转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor-β1, TGF-β1)激活的肝星状细胞中的抗纤维化作用及分子机制。

为阐明7-OCT的抗纤维化潜能，研究人员采用了多学科技术方法：通过细胞活力检测确定7-OCT的安全浓度范围；利用酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)分析纤维化标志物表达；采用蛋白质印迹法(Western Blot)检测关键信号蛋白表达及磷酸化水平；通过Transwell迁移实验评估细胞迁移能力；运用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行全蛋白质组分析；最后结合生物信息学分析和分子对接模拟预测化合物作用靶点。

7-OCT对细胞活力的影响

研究人员首先评估了7-OCT对LX-2（人肝星状细胞）和Huh-7（人肝癌细胞）的细胞毒性。结果显示，7-OCT对LX-2细胞的IC₁₀值为110.76μg/mL，对Huh-7细胞的IC₁₀值为58.70μg/mL。基于此，后续实验选择50μg/mL和100μg/mL作为Huh-7和LX-2细胞的最大安全处理浓度。

7-OCT对活化肝星状细胞标志物表达的影响

在TGF-β1激活的LX-2细胞中，7-OCT显著降低了肝星状细胞活化关键标志物的mRNA表达水平，包括α-平滑肌肌动蛋白(ACTA2)、转化生长因子β受体1(TGFBR1)、I型胶原蛋白α1链(COL1A1)和TIMP金属肽酶抑制剂1(TIMP1)。同时，7-OCT处理还剂量依赖性地降低了基质金属蛋白酶9(MMP-9)的分泌水平，该酶是肝纤维生成的关键介质。

蛋白质印迹分析

蛋白质水平分析进一步证实了7-OCT的抗纤维化作用。在TGF-β1刺激的LX-2细胞中，7-OCT共处理显著降低了α-SMA和磷酸化SMAD3蛋白的表达，而对SMAD2磷酸化影响较小。在Huh-7细胞中也观察到类似趋势，7-OCT处理降低了胶原蛋白I和TIMP1的表达。这些结果表明，7-OCT可能通过干扰TGF-β1/SMAD信号轴发挥抗纤维化作用。

7-OCT处理的LX-2细胞的蛋白质组学分析

为全面揭示7-OCT的作用机制，研究人员进行了标记免费蛋白质组学分析，比较了TGF-β1单独处理与TGF-β1+7-OCT联合处理的LX-2细胞的蛋白质表达谱。结果显示，共有1,570个蛋白质在两个处理组中被共同鉴定出，其中216个蛋白质表达上调，224个下调。

基因本体(Gene Ontology, GO)功能富集分析显示，上调蛋白质主要参与转录后控制和蛋白质管理，如细胞内蛋白质运输、翻译起始调控和RNA剪接；而下调蛋白质则富集于生物合成途径，如基因表达和细胞质翻译。细胞组分分析表明，上调蛋白质主要定位于黏着斑和细胞-基质连接处，而下调蛋白质还独特地富集于细胞核和非膜结合细胞器中。

信号通路分析发现，差异表达蛋白质显著富集于多条信号通路。基于京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)数据库的富集分析显示，上调DEPs主要关联于肌动蛋白细胞骨架调控、查加斯病和胰高血糖素信号通路；而下调DEPs则主要与细菌上皮细胞侵袭、核糖体、凋亡和剪接体通路相关。

蛋白质组学鉴定的通路调控的qRT-PCR验证

蛋白质组学分析显示，7-OCT处理下调了与细胞黏附和肌动蛋白细胞骨架相关的蛋白质，其中整合素连接激酶(Integrin-Linked Kinase, ILK)、玻连蛋白(Vitronectin, VTN)和小窝蛋白1(Caveolin 1, CAV1)是显著富集的黏着斑信号通路的关键组分。qRT-PCR验证结果显示，ILK和VTN的mRNA表达模式与蛋白质组学分析一致，而CAV1的mRNA表达在7-OCT处理24小时后上调。

7-OCT减弱LX-2肝星状细胞的迁移活性

Transwell迁移实验表明，TGF-β1(10 ng/mL)显著促进LX-2细胞迁移，而与7-OCT共处理则显著减弱这种迁移反应。这些发现提示7-OCT可能通过调控黏着斑信号通路，降低LX-2细胞的迁移能力。

蛋白质组学鉴定蛋白质的分子对接分析

分子对接模拟预测了7-OCT与已鉴定蛋白质靶点之间的潜在结合相互作用。分析重点针对TGF-β受体(PDB ID: 8YHF)、SMAD3(PDB ID: 5ODG)和整合素连接蛋白激酶(PDB ID: 4HI8)。结果显示，7-OCT与TGF-β受体的结合得分最高(-5.7)，高于与SMAD3和整合素连接蛋白激酶的结合得分。

本研究首次系统阐明了7-OCT在肝纤维化中的保护作用及分子机制。综合研究结果表明，7-OCT通过干扰TGF-β1/SMAD信号通路，特别是通过下调TGFBR1表达和抑制SMAD3磷酸化，显著抑制肝星状细胞活化标志物（α-SMA、胶原蛋白I和MMP-9）的表达。蛋白质组学分析进一步揭示，黏着斑通路关键蛋白（如ILK、VTN和CAV1）的表达改变可能是7-OCT发挥抗纤维化作用的重要机制。分子对接结果提示，7-OCT与TGF-β受体具有较高的结合亲和力，表明其可能直接作用于该受体而干扰下游信号传导。

值得注意的是，本研究观察到7-OCT对SMAD3磷酸化的抑制具有选择性，对SMAD2影响较小，这与SMAD3在肝纤维化中的核心促纤维化作用一致。同时，CAV1的上调可能通过介导TβRI内化和降解，负向调控TGF-β/SMAD轴，进而抑制肝星状细胞活化。

这项研究不仅为7-OCT的抗肝纤维化活性提供了坚实的实验证据，还通过多组学方法揭示了其潜在的作用靶点和信号通路，为基于天然产物的抗纤维化药物研发提供了新思路。然而，7-OCT与特定靶蛋白的直接相互作用、在更复杂肝纤维化模型中的有效性以及其体内药代动力学特性等问题，仍需进一步深入研究验证。