H5流感病毒抗原进化新机制：关键位点突变模式驱动非线性抗原演化

《Nature Communications》：Dominant substitutions underlying the antigenic evolution of H5 influenza virus

　　本刊编辑推荐：为应对高致病性禽流感H5病毒对全球公共卫生的威胁，研究人员系统阐明了H5流感病毒的抗原进化规律。通过构建涵盖进化史的全面抗原图谱，发现H5病毒可分为三个无交叉中和的抗原簇，并揭示其抗原进化与遗传进化存在非线性关系。研究首次鉴定出6个关键氨基酸位点（88、131、139、199、205、289）的两种突变模式（持续性突变和可逆性突变），这些发现为疫苗株选择和广谱疫苗开发提供了重要指导。

　　

近年来，高致病性禽流感H5病毒在哺乳动物包括人类中的感染事件频频发生，对全球公共卫生构成了重大威胁。自1996年广东鹅源H5N1病毒（GD/96）出现以来，该病毒已在欧洲、非洲、北美和亚洲的野生鸟类种群中迅速传播，并演化出多个谱系。特别是2021年底首次检测到的clade 2.3.4.4b病毒，在家禽和水貂中引发多次溢出事件，随后传播至水鸡、海狮、红狐和条纹臭鼬等野生哺乳动物。更令人担忧的是，2024年3月美国农业部报告了H5N1病毒在牛群中的暴发，同期德克萨斯州报告了一例奶牛工人感染H5N1的病例。此后，clade 2.3.4.4b已扩散至15个州，导致数十人感染和1人死亡。这种人畜共患传播模式的扩大凸显了持续病毒进化可能实现持续人际传播并引发流感大流行的风险。

为应对H5病毒可能引发的大流行威胁，全球已建立了近30种疫苗储备，包括A/Vietnam/1203/2004（clade 1）、A/Indonesia/05/2005（clade 2.1）以及近期加入的A/Astrakhan/3212/2020等毒株。然而，这些储备疫苗对当前流行毒株的保护效果尚待评估。鉴于疫苗的保护效果很大程度上取决于疫苗株与流行病毒之间的抗原匹配程度，阐明H5病毒的抗原关系并确定驱动其抗原进化的关键氨基酸替代，对于评估现有疫苗的有效性和指导未来疫苗株选择至关重要。

尽管以往研究对H5N1抗原进化已有一定探索，但主要集中在单个clade内的变异分析，且缺乏对H5病毒长期进化过程中抗原转换模式及驱动其抗原转换的关键氨基酸替代的系统性研究。为此，张梦怡、秦路瑶等研究人员在《Nature Communications》上发表了最新研究成果，通过构建涵盖不同clade的H5假病毒库，结合豚鼠免疫血清的系统性中和试验，建立了跨越H5流感病毒进化史的全面抗原图谱，揭示了其抗原进化的独特模式，并鉴定了与抗原簇间转换相关的关键氨基酸替代。

研究人员主要采用了假病毒中和试验技术、系统进化分析、位点定向突变技术和抗原图谱构建等关键技术方法。实验选取了135株H5流感病毒毒株（包括24株疫苗株和111株代表性毒株），这些毒株覆盖了H5病毒的所有clade，并均匀分布在H5系统发育树上。通过豚鼠免疫模型获得28种免疫血清，进行高通量中和试验，系统表征H5病毒的抗原特性。

H5流感病毒的抗原进化

研究通过对代表性H5病毒的系统发育树和相应假病毒中和滴度热图分析，识别出三个互不交叉中和的H5病毒抗原簇。第一个对应祖先clade（包括0~9、2.1、2.2、2.3.2、2.3.4），第二个对应2.3.4.4* clade（包括2.3.4.4、2.3.4.4b、2.3.4.4c、2.3.4.4e和2.3.4.4g），自2010年以来占主导地位，第三个对应2.3.4.4h clade。在不同NA亚型（包括H5N1、H5N6和H5N8）中观察到相似的抗原分类。

遗传图谱显示三个抗原簇在遗传空间中呈现连续分布，从祖先到2.3.4.4再到2.3.4.4h，遗传距离逐渐增加。然而抗原进化并不遵循相同的渐进模式：2.3.4.4h与祖先之间的抗原距离小于2.3.4.4与祖先之间的抗原距离。基于对不同抗原的平均滴度计算，祖先免疫血清对2.3.4.4h的中和活性显著高于对2.3.4.4的中和活性，2.3.4.4免疫血清对2.3.4.4h的中和活性强于对祖先的中和活性，而2.3.4.4h免疫血清对2.3.4.4*的中和活性显著高于对祖先的中和活性。这表明在祖先和2.3.4.4h之间存在较大的遗传距离但较小的抗原距离，提示H5流感病毒的抗原和遗传进化之间存在非线性关系。

主要感染人clade的流行病学及现有疫苗的保护效果

流行病学数据显示，祖先clade在2010年前占主导地位，0~9、2.1、2.2、2.3.2和2.3.4等clade相继出现。2010年左右，2.3.4.4* clade出现并逐渐取代祖先clade，其中clade 2.3.4.4b成为主导毒株。2.3.4.4h是一个小clade，在有限地区被检测到，并在2020年后被clade 2.3.4.4b淘汰。自2021年以来有文献记载的人类感染clade包括2.3.2.1a、2.3.2.1c、2.3.4.4b和2.3.4.4h。

尽管2.3.2.1a、2.3.2.1c和2.3.4.4h的采样毒株较少，但它们的有文献记载的人类感染比例（分别为0.68%、7.09%和8.89%）高于最常采样的毒株2.3.4.4b（0.19%）。这一观察表明低流行毒株可能具有高人畜共患潜力，流行病学监测需要重点关注clade 2.3.2.1a、2.3.2.1c和2.3.4.4h。这些clade表现出地理分布受限的特点，主要集中在亚洲国家。其中2.3.2.1a和2.3.2.1c是H5N1特异性的，2.3.4.4h是H5N6特异性的。与上述三个clade不同，分布最广泛的clade 2.3.4.4b分布在多个大洲，包括H5N1、H5N6和H5N8。

进一步分析显示，过去两年世界卫生组织推荐的2.3.4.4b疫苗株CR21和AS20对clade 2.3.4.4b病毒表现出高中和活性，滴度范围在1000-10000之间。此外，TE24（牛源人分离株）免疫血清对clade 2.3.4.4b病毒的中和滴度略高于AS20和CR21。clade 2.3.2的疫苗株对2.3.2.1c的中和效果优于对2.3.2.1a的中和效果。祖先clade中的剩余疫苗株，如VI04和CA07，对这两个clade可以达到约1000的中和水平。clade 2.3.4.4h的疫苗株GD18和代表性毒株GX17对大多数2.3.4.4h病毒的中和抗体水平约为10000。其余两株代表性毒株的免疫原性相对较差。祖先和2.3.4.4clade的疫苗株对2.3.4.4h毒株的中和滴度均低于1000。

相邻抗原簇间的转换机制

在祖先和2.3.4.4* clade之间，鉴定出六个替代：N88R、Q131L、S139P、D199N、K205N和N289H。通过位点定向突变技术评估这些突变单独和不同组合的抗原逃逸能力。在正向验证中，祖先+6M（基于祖先的六个突变）和祖先+K205N显示出对祖先免疫血清约10倍的逃逸，与2.3.4.4相当。反向验证结果显示2.3.4.4-6M（基于2.3.4.4的六个突变）对2.3.4.4免疫血清有约50倍的逃逸，与祖先相当，但2.3.4.4-K205N未导致逃逸。基于双向验证结果，研究人员得出结论：祖先和2.3.4.4clade之间的抗原差异与这六个替代相关。

在2.3.4.4和2.3.4.4h之间，研究人员在相同的六个位点鉴定出氨基酸替代：88、131、139、199、205和289。具体来说，88R、199N和205N突变为88S、199S和205D，而131L、139P和289H回复为131Q、139S和289N。进一步评估显示，2.3.4.4+6'M（基于2.3.4.4的六个突变）和2.3.4.4+L131Q+P139S引起对2.3.4.4免疫血清约10倍的逃逸。反向验证结果显示2.3.4.4h-6'M（基于2.3.4.4h的六个突变）对2.3.4.4h免疫血清有约20倍的逃逸，与2.3.4.4相当，但2.3.4.4h-L131Q-P139S未导致显著逃逸。基于双向验证结果，2.3.4.4*和2.3.4.4h之间的抗原差异与六个替代（R88S、L131Q、P139S、N199S、N205D和H289N）相关。

研究人员由此确定六个氨基酸位点（88、131、139、199、205和289）在三个抗原簇之间的抗原差异中起重要作用。这些位点分布在多个抗原表位上，其中139、199和205位于抗原区B内，289定位到区C，位点88和131分别位于区E和A附近。重要的是，这六个位点表现出两种突变模式：位点88（N>R>S）、199（D>N>S）和205（K>N>D）的持续性突变，以及位点131（Q>L>Q）、139（S>P>S）和289（N>H>N）的可逆性突变。回复突变可能解释了2.3.4.4h在持续遗传进化过程中观察到的抗原回复现象。

祖先clade内抗原差异的机制

祖先clade包括clade 0-9、2.1、2.2、2.3.2和2.3.4。其中，clade 0-9和2.3.4的疫苗株通常能够中和祖先clade中包含的大多数毒株。相比之下，clade 2.1、2.2和2.3.2的疫苗株仅中和其相应的clade毒株，表明2.1、2.2和2.3.2*存在一定程度的抗原漂移。

进一步研究发现，GD96和clade 2.1之间的抗原差异由四个替代（N61D、D142E、S157P和E228K）驱动；GD96和clade 2.2之间的抗原差异与三个替代（N61D、D142E和E228K）相关；而GD96和clade 2.3.2*之间的抗原差异可能与十个突变（R69K、D110N、N140D、S145L、S149A、H154Q、S171N、K205R、E243D和L285V）相关。结构分析显示这些突变主要集中在五个表位，特别是表位A（140、142、154、157）和B（171、172、205），表明这些区域是H5病毒抗原变异的热点区域。

本研究通过假病毒系统构建了H5流感病毒的全面抗原图谱，系统阐明了其非线性抗原进化模式，并鉴定了与抗原进化相关的氨基酸替代。研究发现三个抗原簇在NA亚型、宿主范围和地理分布上表现出特征性模式，且抗原距离与遗传距离之间存在解耦现象。这种独特的非线性抗原进化模式与H3N2和H1N1亚型中观察到的模式不同，凸显了不同流感病毒亚型抗原进化模式的多样性。

关键的六氨基酸位点表现出两种不同的突变模式，其中回复突变表明病毒在获得免疫逃逸能力的同时，需要保持基本的结构稳定性和生物学功能之间的平衡。结构上，这些关键位点在HA蛋白上呈现多样分布特征，部分位点直接暴露于免疫识别，部分位于侧面或茎区附近。回复突变可能有助于恢复该区域必要的构象灵活性或维持适当的疏水性和空间结构，而位点289的回复可能对维持原始糖基化模式至关重要。

在祖先clade内，疫苗株的保护范围存在差异，这种抗原特异性与多个位点的协同效应相关。研究验证过程中观察到双向验证结果的一些不一致性，表明其他未验证位点可能也有贡献，这反映了验证方法的局限性。

值得注意的是，大多数鉴定的抗原位点位于HA头部域，类似于人类流感病毒H3N2和H1N1中观察到的免疫逃逸突变分布。由于H5病毒目前主要在鸟类物种中传播，仅偶尔感染人类而不具备持续人际传播能力，研究人员推测其暴露于人类免疫选择压力的程度相对较低。然而，如果H5病毒获得有效的人际传播能力，其抗原进化模式可能会发生改变。

综上所述，本研究不仅增进了对H5流感病毒抗原进化机制的理解，而且为疫苗株选择和广谱疫苗开发提供了重要见解。鉴于H5病毒持续演变和对全球公共卫生的潜在威胁，建立全面的监测系统同时开发广泛保护性疫苗至关重要。研究强调需要对H5抗原变异进行持续监测，并建议在开发广泛保护性疫苗的同时，重点关注具有高人畜共患潜力的低流行毒株。