嗜热丝菌琥珀酸脱氢酶结构揭示甲萘醌还原的电子与质子传递机制

《Nature Communications》：Structural basis of menaquinone reduction by succinate dehydrogenase from Chloroflexus aurantiacus

　　本研究针对MK依赖型SQR催化琥珀酸氧化与低电位MK还原的吸能反应机制不明确的问题，通过解析Chloroflexus aurantiacus琥珀酸脱氢酶(CaSDH)的冷冻电镜结构，首次在单膜锚定亚基中发现典型QP位点和新型QD位点，结合EPR和酶学分析揭示了双血红素SQR中独特的电子传递路径，为针对病原菌中同类酶的抑制剂设计提供了结构基础。

　　

在生命体的能量代谢网络中，琥珀酸脱氢酶（Succinate Dehydrogenase, SDH）或称线粒体复合物II，扮演着承上启下的关键角色。它既是三羧酸循环（TCA循环）的重要组成部分，催化琥珀酸氧化为延胡索酸；又是呼吸链的成员，将电子进一步传递给醌类分子。然而，有一类特殊的琥珀酸:醌氧化还原酶（SQR）——它们依赖低氧化还原电位的甲萘醌（Menaquinone, MK）作为电子受体。催化琥珀酸氧化（一个放能反应）来还原低电位的MK（一个吸能反应），这一过程如何被驱动，其具体的电子和质子传递机制长期以来是领域内悬而未决的核心问题。

为了解决这一难题，研究人员将目光投向了一种古老的、代谢方式多样的光合细菌——Chloroflexus aurantiacus。这种细菌是绿色丝状非硫光合细菌（Filamentous Anoxygenic Phototrophs, FAPs）的代表，其呼吸链只使用MK。更重要的是，它编码一种只包含单个膜锚定亚基（SdhC）的双血红素SQR，命名为CaSDH。这种简单的亚基组成使其成为研究MK依赖型双血红素SQR工作机制的理想模型。解析CaSDH的结构，有望从根本上揭示其耦合琥珀酸氧化与MK还原的独特机制。

本研究综合运用了冷冻电镜（cryo-EM）单颗粒分析技术，解析了CaSDH在天然状态（apo-form）、脂质结合状态（lipid-bound）以及与两种MK（MK4和MK7）结合状态下的高分辨率结构。通过电子顺磁共振（EPR）波谱分析了酶中各个氧化还原中心（铁硫簇、血红素）在不同氧化还原状态下的变化。利用酶学活性测定（包括琥珀酸:DCPIP氧化还原酶活性和延胡索酸还原酶活性）验证了CaSDH的功能。此外，还通过分子动力学（MD）模拟计算了MK在不同结合位点的结合自由能，以评估其结合偏好。

CaSDH组成和整体结构

研究人员首先从光自养生长的C. aurantiacus细胞中纯化出具有活性的CaSDH复合物。冷冻电镜结构分析揭示，CaSDH是一个类似三叉戟形的同源三聚体，每个单体由三个亚基组成：黄素蛋白亚基SdhA（结合FAD和黄素腺嘌呤二核苷酸辅因子及琥珀酸）、铁硫蛋白亚基SdhB（包含[2Fe-2S]、[4Fe-4S]和[3Fe-4S]三个铁硫簇）以及单个膜锚定亚基SdhC（包含5个跨膜螺旋和两个b型血红素，分别称为近端血红素b_P和远端血红素b_D）。

SdhA结构和琥珀酸结合口袋构象变化

SdhA的结构与其他已报道的SQR相似，具有典型的Rossmann折叠架构。值得注意的是，CaSDH的SdhA拥有一个N端延伸（“N-螺旋”），该结构域在三聚体界面与其他单体相互作用，对维持三聚体结构稳定性有重要作用，这是CaSDH的一个特征。在天然状态结构中，琥珀酸底物结合在SdhA的活性中心。而在MK结合结构中，负责底物结合的S304E305S306环等区域发生了显著的构象变化，导致底物结合口袋打开，这可能与延胡索酸产物的释放有关。

SdhC拥有单个膜锚定亚基和两个b型血红素

作为B型SQR的代表，CaSDH仅含有一个膜锚定亚基SdhC，这与哺乳动物、大肠杆菌等含有两个膜锚定亚基的SQR（如SdhC和SdhD）形成鲜明对比。SdhC的五个跨膜螺旋包裹着两个相互垂直的b型血红素（b_P和b_D），其空间排列与来自沃林氏菌和巨大脱硫弧菌的QFR（Quinol:Fumarate Reductase）相似，但与结核分枝杆菌Sdh2（含有三个膜锚定亚基）和典型SQRs存在明显差异。

甲萘醌（MK）结合位点

结构分析最关键的发现之一是鉴定出两个不同的MK结合位点。一个是典型的近端醌结合位点（Q_P），位于SdhB和SdhC的界面，紧邻[3Fe-4S]簇。MK的头基与SdhC上的关键残基Asp-C118和Tyr-C119形成氢键，其异戊二烯侧链伸入SdhC的TM2和TM3螺旋之间的疏水缝隙中。该位点的空间组织与泛醌（UQ）依赖的SQRs中的Q_P位点相似。

另一个是此前未被认识的远端醌结合位点（Q_D）。该位点位于膜的中心区域，靠近远端血红素b_D，由一个由跨膜螺旋TM2和TM3及其连接环形成的疏水裂缝构成。MK的头基与一个保守性不高的Glu-C64残基相互作用。这个Q_D位点的位置、构型和特异性都与之前在大肠杆菌QFR或结核分枝杆菌Sdh2中报道的Q_D位点不同，是Chloroflexi菌门酶的一个特征性结构。

电子传递路径

氧化还原中心的排列勾勒出从琥珀酸氧化到MK还原的潜在电子传递路径。来自琥珀酸氧化的电子依次通过FAD、[2Fe-2S]簇、[4Fe-4S]簇到达[3Fe-4S]簇。此后，路径出现分叉：电子可以直接传递给结合在Q_P位点的MK使其还原，或者继续传递，依次经过血红素b_P和b_D，最终还原结合在Q_D位点的MK。

EPR分析证实，琥珀酸氧化释放的电子能够还原铁硫簇和b型血红素，而加入MK后，部分信号恢复，表明电子被传递给了MK。分子动力学模拟进一步显示，MK与Q_D位点的结合自由能显著低于Q_P位点，表明Q_D位点对MK结合更具优势。这些结果共同提示，在CaSDH中，电子更倾向于通过b型血红素链传递至Q_D位点来还原MK。

综上所述，这项研究通过解析CaSDH的高分辨率冷冻电镜结构，揭示了一种在单个膜锚定亚基中含有两个功能迥异的MK结合位点（典型的Q_P位点和新型的Q_D位点）的独特架构。结合生物化学和计算生物学分析，研究阐明了电子优先经由双血红素链传递至Q_D位点还原MK的路径。特别值得注意的是，CaSDH的Q_D位点使用了一个保守性不高的Glu64残基进行MK结合和还原，且缺乏典型的“E路径”谷氨酸残基，这意味着MK在Q_D位点的还原强烈依赖于由呼吸链其他复合物建立的跨膜电化学质子梯度（质子动力势）来驱动这一吸能反应。这种机制使细菌能够根据环境能量状态（如好氧呼吸产生高质子动力势，或光合作用导致膜去能化）灵活选择使用Q_D或Q_P位点进行MK还原，体现了其代谢的适应性。

该研究不仅首次在结构上阐明了MK依赖型双血红素SQR的醌结合位点和电子传递机制，解决了该领域长期存在的关键问题，而且具有重要的转化价值。许多人类病原菌，如幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）和空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni），其生存所必需的QFR酶与CaSDH在结构和功能上相似。因此，本研究揭示的独特结构特征，特别是那个非常规的Q_D位点，为针对这些病原菌开发新型、特异的抗菌药物提供了精确的分子蓝图和结构基础。这项发表于《Nature Communications》的工作，是理解生命早期分支光合细菌能量代谢机制的一项重要突破。