酵母甲醇生物转化制备可生物降解塑料单体L-乳酸

《Nature Communications》：Methanol biotransformation for the production of biodegradable plastic monomer L-lactate in yeast

　　本研究针对不可降解塑料污染及化石资源依赖问题，通过多维代谢工程改造甲基营养酵母Ogataea polymorpha，实现了以CO2衍生的甲醇为底物高效合成可生物降解塑料聚乳酸（PLA）单体L-乳酸。研究人员通过优化乳酸脱氢酶（Ldh）表达、增强细胞活力、调控辅因子稳态及实施线粒体区室化等策略，在发酵罐中获得25.0 g/L的L-乳酸产量。结合技术经济分析（TEA）和生命周期评估（LCA），证实该路径具备经济可行性和碳负排放潜力，为碳中和背景下生物基塑料的可持续生产提供了新范式。

　　

白色污染日益严重，不可降解的石油基塑料碎片形成的微塑料已对人类健康构成威胁。聚乳酸（PLA）作为最具应用前景的生物可降解塑料，其单体乳酸的传统生产方法依赖粮食基原料或复杂的木质纤维素预处理工艺，面临“与粮争地”和技术经济性挑战。将温室气体CO₂转化为化学品的三代生物炼制技术，特别是以甲醇为底物的生物转化过程，因其高能量密度和易储存运输特性，成为实现碳负排放的关键路径。然而，甲醇代谢的刚性及产物合成与细胞生长间的激烈竞争，尤其是辅因子NADH的剧烈争夺，严重制约了化学品的高效合成。

发表于《Nature Communications》的这项研究，通过系统改造甲基营养酵母Ogataea polymorpha，成功构建了以甲醇为唯一碳源高产L-乳酸的细胞工厂。研究团队首先筛选出来自Pediococcus acidilactici的L-乳酸脱氢酶（PaLdh）作为最优催化剂，通过基因组整合替代质粒表达，使摇瓶产量提升至1.2 g/L。针对乳酸合成导致的细胞生长延迟，发现缺失膜蛋白编码基因IZH3可显著提高细胞活力，将乳酸产量进一步提升23%。研究的关键突破在于发现甲醇代谢过程中NADPH/NADP⁺的比值显著高于NADH/NAD⁺，通过点突变（V40R）将PaLdh的辅因子偏好性从NADH改造为NADPH，成功缓解辅因子竞争压力，使产量提升31%。更巧妙的是，团队在线粒体内定位NADH依赖型Ldh，利用线粒体内丰富的丙酮酸和NADH构建第二合成路径，实现胞质与细胞器的双路径合成。

在规模化验证中，采用CO₂经液态阳光技术合成的甲醇进行补料发酵，最终获得25.0 g/L的L-乳酸产量，产率达0.22 g/g甲醇，为目前一碳原料合成乳酸的最高水平。技术经济分析显示，该过程的乳酸最低售价（MSP）为2.29美元/千克，与市场价相当；生命周期评估表明，每生产1千克乳酸可固定7.29千克CO₂，实现碳负排放。该研究首次将液态阳光技术与甲醇生物转化耦合，建立了从CO₂到可降解塑料的闭环产业链，为白色污染和温室效应协同治理提供了创新解决方案。

研究采用的主要技术方法包括：基于CRISPR-Cas9的基因编辑系统进行基因敲除和整合；利用流式细胞术进行碘化丙啶（PI）染色检测细胞死亡率；通过荧光显微镜观察线粒体定位效率；采用高效液相色谱（HPLC）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析代谢产物；使用Aspen Plus流程模拟软件进行技术经济分析和生命周期评估。

实验结果分析

构建甲醇至L-乳酸的生物合成路径

通过筛选五种乳酸菌来源的L-乳酸脱氢酶基因，发现Pediococcus acidilactici的PaLdh在甲醇诱导型启动子P_AOX1控制下效果最优。将PaLDH整合至基因组中性位点NS3后，乳酸产量达655 mg/L。恢复LEU2基因可增强菌株稳定性，使工程菌HPLA06产量提升至1.2 g/L。

增强甲醇环境下的细胞活力

乳酸合成与三羧酸循环竞争丙酮酸导致生长延迟。缺失IZH3基因可通过降低细胞死亡率（PI阳性率从10%降至5%）提高乳酸产量23%，而缺失LPL1基因则因促进磷脂降解反而降低产量。适应性实验室进化虽提高生物量128%，但乳酸产量下降62%，表明细胞生长与产物合成存在权衡。

工程化辅因子稳态促进乳酸合成

甲醇主要通过磷酸戊糖途径产生NADPH，而乳酸合成需NADH。将PaLdh的辅酶偏好性改造为NADPH（V40R突变）后，两拷贝整合菌株HPLA13的NADPH/NADP⁺与NADH/NAD⁺比值趋于平衡，产量提高31%。该策略在葡萄糖培养中无效，印证了甲醇代谢的高NADPH特性。

线粒体区室化Ldh实现双路径合成

利用细胞色素氧化酶亚基IV的线粒体靶向信号将NADH依赖型PaLdh定位于线粒体，利用其富集的丙酮酸和NADH合成乳酸。胞质（NADPH路径）与线粒体（NADH路径）协同作用使工程菌HPLA22产量达2.5 g/L，产率0.25 g/g。

反应器补料发酵验证生产潜力

采用CO₂衍生甲醇（浓度593 g/L）进行补料发酵，最终产量达25.0 g/L，产能为99.2 mg/L/h。技术经济分析表明，年产18,500吨的装置中，生物反应器是设备投资主要部分；生命周期评估显示每千克乳酸全球变暖潜能值（GWP）为1.74 kg CO₂-eq，电力消耗（52.19%）和氮源（14.62%）为主要排放源。

研究结论与展望

该研究通过酶分子改造、辅因子工程、细胞器功能化等多维度策略，成功将Ogataea polymorpha重编程为高效甲醇转化平台。研究首次揭示甲醇代谢中NADPH优势的生理特性，并创新性通过线粒体分区优化碳流和辅因子利用效率。技术经济与生命周期评估证明CO₂至乳酸的产业链兼具经济性与碳负排放特性，为生物制造领域提供了从碳捕获到可降解材料闭合循环的示范。该平台策略可推广至其他有机酸及还原性化学品的生物合成，助力碳中和目标下化工产业的绿色转型。