过表达甘薯重金属相关异戊二烯化蛋白基因IbHIPP7降低镉积累并缓解镉毒性的机制研究

《Horticulture Research》：Overexpression of the heavy metal-associated Isoprenylated plant protein (HIPP) gene IbHIPP7 reduces cadmium accumulation and alleviates cadmium toxicity in sweetpotato

　　本研究针对农田土壤镉(Cd)污染威胁作物安全与人体健康的问题，聚焦甘薯重金属相关异戊二烯化植物蛋白(HIPP)基因IbHIPP7的功能解析。研究人员通过转基因技术发现，过表达IbHIPP7能显著增强甘薯对Cd的耐受性，降低根和地上部Cd积累量(分别减少28%、42%和38%)。该研究为培育低Cd积累甘薯品种提供了关键基因靶点，对保障农产品安全具有重要意义。

　　

随着工业化进程的加速，农田土壤重金属污染已成为全球性的环境问题。其中，镉(Cd)作为一种具有高生物毒性的重金属元素，不仅会抑制植物生长，导致叶片黄化、根系褐变等可见症状，还能通过食物链在人体内富集，引发肾功能损害、骨痛病等健康问题。甘薯(Ipomoea batatas)作为全球第七大粮食作物，其茎尖因富含蛋白质、膳食纤维和矿物质而被誉为"蔬菜皇后"。然而，研究发现甘薯茎叶对Cd的富集能力显著高于块根，这给以茎叶为食用部位的蔬菜型甘薯带来了更大的食品安全风险。因此，解析甘薯响应Cd胁迫的分子机制，培育低Cd积累品种，对保障农产品安全具有重要意义。

在植物应对重金属胁迫的机制中，重金属相关异戊二烯化植物蛋白(HIPP)是一类仅在维管植物中存在的金属分子伴侣。它们通过其保守的重金属相关(HMA)结构域参与重金属的螯合和转运，在植物重金属解毒过程中发挥关键作用。然而，HIPP家族成员在甘薯中的功能尚未明确。南京农业大学陈亚华教授团队在《Horticulture Research》上发表了题为"Overexpression of the Heavy metal-associated Isoprenylated Plant Protein(HIPP) gene IbHIPP7 reduces cadmium accumulation and alleviates cadmium toxicity in sweetpotato"的研究论文，系统解析了甘薯IbHIPP7基因在Cd吸收和解毒中的功能。

研究人员主要采用了基因克隆与生物信息学分析、亚细胞定位、酵母异源表达系统、拟南芥遗传转化、甘薯毛根转化、非损伤微测技术(NMT)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)等技术方法。实验材料包括甘薯品种福菜薯18和苏薯33，通过农杆菌介导的遗传转化获得转基因材料，并利用Cd污染土壤进行盆栽验证。

Isolation, characterization and phylogenetic analysis of IbHIPP7

通过转录组分析从福菜薯18中鉴定到一个受Cd诱导表达的HIPP基因IbHIPP7。该基因包含6个内含子和7个外显子，编码一个含269个氨基酸的蛋白质，预测分子量为30.5 kDa，等电点(pI)为5.97。序列分析显示IbHIPP7含有两个保守的HMA结构域和一个C末端异戊二烯化 motif。系统进化分析表明，IbHIPP7与旋花科植物三裂叶薯(Ipomoea triloba)的HIPP7亲缘关系最近。

Expression profiles of IbHIPP7

组织特异性表达分析显示，IbHIPP7在叶片中表达量最高，其次为叶柄、茎和根。Cd处理实验发现，随着CdCl₂浓度增加，叶柄中IbHIPP7表达量先升高后降低，在25μM时达到峰值，而叶片和相邻茎段中表达无显著变化，表明IbHIPP7可能特异性地参与叶柄的Cd应激响应。

Subcellular localization of IbHIPP7

通过烟草瞬时表达系统发现，GFP-IbHIPP7融合蛋白的绿色荧光信号与细胞膜标记mCherry-PM和FM4-64的红色荧光信号重合，表明IbHIPP7定位于细胞膜。这一结果在稳定转化的甘薯原生质体和叶表皮细胞中得到进一步验证。

Heterologous expression of IbHIPP7 confers Cd tolerance in yeasts

将IbHIPP7在酵母菌株Y252中异源表达后，发现表达IbHIPP7的酵母在含100μM CdCl₂的SD-Ura平板上生长显著优于空载体对照。生长曲线显示，在100μM CdCl₂处理下，IbHIPP7表达菌株的OD₆₀₀值显著高于对照。细胞内Cd含量测定表明，IbHIPP7表达使酵母细胞内Cd积累量降低40%，说明其通过减少Cd吸收来增强Cd耐受性。

Key functional domains of IbHIPP7

通过构建HMA结构域金属离子结合位点和C末端异戊二烯化motif的缺失突变体，发现缺失任一个HMA结构域都会使IbHIPP7完全丧失Cd耐受功能，而缺失异戊二烯化motif则不影响其功能。这表明两个HMA结构域是IbHIPP7发挥Cd解毒功能所必需的。

Specificity of IbHIPP7 in Metal Chelation and Detoxification

进一步研究发现，IbHIPP7对Cu²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺和Fe²⁺的毒性没有缓解作用，显示其对Cd²⁺具有特异性的螯合和解毒能力。

IbHIPP7-overexpression enhances Cd tolerance in arabidopsis

在拟南芥中过表达IbHIPP7显著增强了转基因植株对Cd的耐受性。在含Cd培养基上，转基因株系的主根长度显著长于野生型。ICP-MS分析显示，转基因植株地上部和根部的Cd积累量均显著低于野生型。NMT检测发现，转基因植株根尖300μm处的Cd²⁺吸收速率显著低于野生型，表明IbHIPP7过表达通过降低根系对Cd的吸收来减少Cd积累。

IbHIPP7-overexpression inhibited the uptake and accumulation of Cd by the roots of sweetpotatoes

通过农杆菌介导的毛根转化技术获得过表达IbHIPP7的甘薯毛根，发现转基因毛根在5μM CdCl₂处理下Cd积累量显著低于野生型。NMT检测显示，转基因毛根表面的Cd²⁺内流速率显著降低。

Functional validation of IbHIPP7 in transgenic sweetpotato(Sushu33) at the whole-plant level

在苏薯33中过表达IbHIPP7，发现转基因叶片在300μM CdCl₂处理下仍保持绿色，而野生型叶片完全黄化。DAB和NBT染色显示转基因叶片中活性氧(ROS)积累显著减少。盆栽实验表明，在Cd污染土壤(5.3 mg/kg)中，转基因植株根、茎、叶的生物量显著高于野生型，且根、茎、叶中的Cd浓度分别降低了28%、42%和38%。值得注意的是，虽然叶柄中的Cd浓度没有显著差异，但转基因植株叶柄Cd含量占地上部总Cd含量的比例显著增加，提示IbHIPP7可能通过调节叶柄的生理功能来调控Cd在地上部的转运和再分配。

讨论部分指出，HIPP蛋白作为金属分子伴侣，通过其HMA结构域结合重金属离子，并将其转移至金属转运蛋白，通过细胞膜外排或液泡区隔化来维持细胞内离子稳态。本研究首次揭示了IbHIPP7在甘薯Cd解毒中的关键作用：其通过定位于细胞膜，减少根系对Cd的吸收，从而降低植株体内的Cd积累。特别值得注意的是，IbHIPP7在叶柄中受Cd诱导表达，且过表达后改变了Cd在地上部的分配模式，表明它可能通过调控叶柄的Cd转运功能来影响Cd的再分配。

该研究不仅阐明了IbHIPP7在甘薯Cd耐受中的分子机制，为理解植物重金属解毒机制提供了新视角，而且为培育低Cd积累的甘薯品种提供了重要的基因资源，对保障农产品安全和重金属污染土壤的植物修复具有重要应用价值。