噬菌体λP装载蛋白调控DnaB解旋酶加载的独特四聚态与自抑制机制的结构解析

《Nucleic Acids Research》：Distinct quaternary states, intermediates, and autoinhibition during loading of the DnaB-replicative helicase by the phage λP helicase loader

　　本研究针对细菌复制起始过程中DnaB解旋酶如何被装载蛋白精确加载到DNA复制起点这一关键科学问题，通过高分辨率冷冻电镜技术首次解析了λP噬菌体装载蛋白与大肠杆菌DnaB解旋酶复合物的两种不同构象状态（B6P5和B6P6）。研究发现B6P5复合物中一个λP亚基跨越解旋酶开口形成空间位阻，揭示了复制起点ssDNA"气泡"加载过程中的自抑制机制，而B6P6则代表了解旋酶加载途径中的早期中间态。该研究为理解细菌染色体复制起始的分子机制提供了重要的结构基础。

　　

在生命的基本过程中，DNA复制是维持遗传信息稳定传递的核心环节。细菌染色体作为无限长的环状DNA分子，其复制起始需要专门的解旋酶装载蛋白将复制型解旋酶精确安置在复制起点。大肠杆菌DnaB解旋酶作为细菌复制机制的核心组件，需要形成六聚体环状结构环绕单链DNA，通过ATP水解驱动沿DNA的定向移动从而实现双链分离。然而，环状DNA缺乏自由末端的特点使得DnaB的加载成为复制起始过程中的关键瓶颈。

长期以来，科学家们对解旋酶装载机制提出了三种主要模型：环开口模型、环形成模型和环闭合模型。其中，噬菌体λP蛋白和大肠杆菌DnaC蛋白作为典型的环开口型装载蛋白，虽然序列和结构无关，却通过趋同进化实现了相似的装载机制。这两种蛋白都能将闭合平面状的DnaB重塑为开放的右手螺旋构象，同时抑制DnaB的ATP酶活性和DNA解链活性。然而，此前关于λP-DnaB复合物的4.1?冷冻电镜结构由于分辨率限制，仅能解析约50%的λP装载蛋白结构，特别是其与解旋酶的相互作用界面、DnaB重塑机制以及单链DNA进入中央通道的途径等关键问题仍未完全阐明。

为了深入解析这些机制，研究人员开展了系统的结构生物学研究。他们首先通过蛋白质工程技术筛选获得可溶性的λP蛋白结构域（残基105-210），并利用X射线晶体学解析了其高分辨率结构。随后，研究人员制备了DnaB-λP复合物样品，并通过冷冻电镜技术获得了三种不同状态的结构数据：2.66?的B₆P₅复合物、2.84?的B₆P₅复合物以及3.85?的B₆P₆复合物。此外，研究还采用了天然质谱分析技术验证复合物的化学计量组成，并通过NADH偶联的微孔板分光光度法测定ATP水解速率。

研究结果揭示了λP-DnaB复合物存在的两种截然不同的四聚态。2.66?高分辨率结构显示，B₆P₅复合物中五个λP装载蛋白分子形成皇冠状结构，紧密地包裹着DnaB解旋酶。在这一复合物中，原本闭合平面的DnaB被重构为开放螺旋构象，其CTD（羧基末端结构域）层产生足够大的开口（约10.5?），允许单链DNA进入内部空腔。

尤为意外的是，研究发现一个λP链（链Z）位于DnaB螺旋的开口处，其结构域I和II跨越了解旋酶的断裂界面。这种独特的空间排布意味着，虽然DnaB的NTD（氨基末端结构域）和CTD层都存在足以允许单链DNA进入的开口，但λP链Z的阻挡作用使得生理条件下的复制起点衍生的ssDNA"气泡"难以直接进入B₆P₅复合物的中央空腔。这一发现提示B₆P₅复合物可能代表了一种自抑制状态，其加载过程可能涉及多个步骤和结构重排。

相比之下，B₆P₆复合物呈现出完全不同的构象特征。在这种六聚体复合物中，DnaB保持近乎平面的构型，CTD层呈现"微开平面"状态，没有明显的断裂开口。λP装载蛋白的六个拷贝与DnaB的结合较为松散，其中两个λP链的结构域III由于空间位阻而无法有序排列。这种构象的灵活性以及未完全形成的蛋白质界面表明B₆P₆复合物代表了解旋酶加载途径中的早期中间态。

研究人员进一步分析了λP装载蛋白与DnaB解旋酶之间的相互作用界面。在B₆P₅复合物中，鉴定出五个不同的结合位点，这些位点广泛分布于DnaB的特定结构域上。其中，λP的羧基末端套索结构域与DnaB的DH（对接螺旋）-LH（连接螺旋）界面结合，几乎完全破坏了该界面原有的疏水相互作用，形成了三螺旋束组装体。DH-LH界面被鉴定为解旋酶加载途径中的关键结构枢纽，其构象变化直接关联到DnaB从闭合平面状态向开放螺旋状态的转变。

研究还探讨了单链DNA在B₆P₅复合物中的可能路径。已知λP的Phe99残基能够与单链DNA发生交联，在B₆P₅复合物中，五个Phe99残基在λP结构域II形成的内部空腔内呈蜿蜒分布。然而，与转运状态的DnaB-ssDNA复合物相比，B_{6P5复合物中的DNA结合位点明显扭曲，且由于λP结构域III与DnaB CTD之间的空间位阻，中央空腔无法达到活性构象。}

基于这些结构发现，研究人员提出了DnaB解旋酶加载的完整途径模型：从闭合平面状态的DnaB₆开始，六个λP装载蛋白分子结合形成微开平面的B₆P₆中间态；随后通过构象重排和一個λP链的释放，转变为开放螺旋的B₆P₅复合物；最后在分子伴侣蛋白（DnaK、DnaJ和GrpE）的协助下，λP装载蛋白被驱逐，DnaB转变为能够进行DNA解链的闭合螺旋构象。

这项研究的意义在于首次提供了λP-DnaB解旋酶装载复合物的高分辨率结构视图，揭示了细菌复制起始过程中前所未有的结构细节。研究发现的一个λP亚基跨越DnaB开口的自抑制机制，为理解复制起点"气泡"加载的复杂性提供了新的视角。同时，对B₆P₆中间态的鉴定完善了解旋酶加载途径的动力学模型。这些发现不仅深化了对细菌DNA复制起始机制的理解，也为针对细菌复制机制的抗菌药物开发提供了新的结构基础。

该研究发表于《核酸研究》（Nucleic Acids Research）杂志，通过综合运用X射线晶体学、冷冻电镜和生物化学分析等先进技术，为细菌染色体复制起始领域做出了重要贡献。研究结果展示了自然界通过趋同进化解决复杂生物学问题的精巧策略，也为后续研究DnaB解旋酶加载过程中的动态构象变化及其调控机制奠定了坚实基础。