蛋白去糖基化酶DJ-1通过调控Dusp1/P38MAPK通路抑制病毒性心肌炎心肌细胞凋亡的作用及机制研究

《Cell Death & Disease》：Protein deglycase DJ-1 deficiency aggravates acute viral myocarditis by promoting apoptosis via reducing Dusp1 expression

　　本研究针对急性病毒性心肌炎(VMC)中心肌细胞凋亡的调控机制，首次揭示了蛋白去糖基化酶DJ-1在柯萨奇病毒B3(CVB3)感染中的保护作用。研究人员通过体内外实验证实DJ-1缺失会通过下调Dusp1表达激活P38MAPK通路，从而加剧心肌细胞凋亡和VMC严重程度；而DJ-1过表达则能显著缓解心肌损伤。该发现为VMC的治疗提供了新的潜在靶点，具有重要的临床转化价值。

　　

在心血管疾病研究领域，急性病毒性心肌炎(acute viral myocarditis, VMC)一直是一个严峻的临床挑战。这种以心肌炎症和损伤为特征的疾病，特别青睐婴幼儿和青少年群体，其中柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3, CVB3)是最常见的元凶。尽管部分患者能够自发康复，但约20%的病例会进展为慢性阶段，最终导致扩张型心肌病和充血性心力衰竭，严重威胁患者生命。

多年来，研究者们已经认识到心肌细胞凋亡在VMC发病过程中扮演着关键角色。早在1994年，Kawano等人就首次通过心肌活检报告了慢性心肌炎患者中存在多灶性心肌细胞凋亡。随后的研究进一步证实，CVB3感染的小鼠体内存在大量凋亡的心肌细胞。病毒通过表达2A和3C两种蛋白酶，能够同时激活外源性Caspase-8介导的途径和内源性线粒体介导的凋亡途径，导致心肌细胞程序性死亡。然而，调控这一过程的具体分子机制仍不清楚，这也成为制约VMC有效治疗策略开发的瓶颈。

在这一背景下，山东大学附属山东省医院心血管内科袁海涛和王兆阳团队将目光投向了一个多功能的蛋白质——蛋白去糖基化酶DJ-1。这种23kDa的蛋白质最初被鉴定为癌基因，在转录调控、线粒体功能、蛋白水解和自噬等多种细胞过程中发挥重要作用。更引人注目的是，DJ-1以其抗氧化和抗凋亡效应在心血管疾病研究中崭露头角，已在缺血再灌注损伤、肺动脉高压、心肌肥大和心力衰竭等模型中显示出保护作用。然而，DJ-1在VMC中的具体角色及其对心肌细胞凋亡的调控机制，仍然是一个未解之谜。

为了解开这个谜团，研究团队设计了一系列精巧的实验。他们首先观察到在CVB3感染的H9C2细胞和VMC小鼠心脏组织中，DJ-1的表达水平显著降低，这提示DJ-1可能参与VMC的病理过程。随后，他们利用DJ-1基因敲除(DJ-1^-/-)小鼠模型，令人信服地证明了DJ-1缺失会加剧CVB3诱导的心肌损伤：小鼠存活率下降、体重减轻更明显、心脏功能指标左心室射血分数(LVEF)和左心室短轴缩短率(LVFS)进一步恶化。组织学分析显示，DJ-1敲除小鼠心脏中的炎症细胞浸润更加严重，血清中的心肌损伤标志物心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I, cTnI)和促炎细胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)水平也显著升高。

研究团队采用了多种关键技术方法开展研究。他们使用6-8周龄雄性C57BL/6小鼠构建CVB3诱导的VMC模型，通过腺相关病毒(AAV)介导的基因操作在体内调控DJ-1表达。在细胞水平，利用H9C2心肌细胞系，通过小干扰RNA(siRNA)和腺病毒(Adv)进行基因沉默或过表达。采用超声心动图评估心功能，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清标志物，TUNEL染色和流式细胞术分析细胞凋亡，Western blot和实时定量PCR(qRT-PCR)检测分子表达，并通过RNA转录组测序筛选下游靶点。

DJ-1表达在CVB3感染后降低

研究人员首先通过qRT-PCR和Western blot分析发现，CVB3感染的H9C2细胞和小鼠心脏组织中DJ-1的mRNA和蛋白表达水平均显著下降，免疫荧光染色结果进一步证实了这一发现，表明CVB3感染会降低DJ-1表达水平。

DJ-1缺失加剧CVB3诱导的心肌损伤

通过比较野生型和DJ-1敲除小鼠在CVB3感染后的表现，研究发现DJ-1缺失会显著降低小鼠存活率，加重体重减轻程度，恶化心脏收缩和舒张功能，增加心肌炎症浸润程度，并升高血清中心肌损伤标志物和促炎细胞因子水平，证明DJ-1缺失会加剧VMC的严重程度。

DJ-1缺陷加重心肌细胞凋亡

研究人员发现DJ-1缺失并不影响病毒复制，但会显著增加心肌细胞凋亡。TUNEL染色显示DJ-1敲除小鼠心脏中凋亡细胞数量增加，流式细胞术检测发现si-DJ-1处理的H9C2细胞凋亡率升高，Western blot分析显示cleaved caspase-3水平上升而pro-caspase-3水平下降，表明caspase-3活性增强，证明DJ-1缺陷通过促进凋亡加剧VMC。

DJ-1过表达缓解病毒性心肌炎

通过AAV-DJ-1介导的DJ-1过表达实验证明，恢复DJ-1水平能够提高小鼠存活率，减轻体重下降，改善心脏功能，减少心肌炎症浸润，降低血清中心肌损伤标志物和促炎细胞因子水平，表明DJ-1过表达对VMC具有治疗作用。

DJ-1过表达抑制CVB3感染诱导的凋亡

进一步机制研究表明，DJ-1过表达能够降低H9C2细胞的凋亡率，减少cleaved caspase-3水平，抑制caspase-3活性，证实DJ-1通过抗凋亡作用发挥心肌保护效应。

DJ-1缺陷下调Dusp1基因表达

通过RNA转录组测序，研究人员发现DJ-1敲除小鼠心脏中有191个基因表达下调，其中双特异性磷酸酶1(dual-specificity phosphatase 1, Dusp1)的变化最为显著。KEGG分析显示这些下调基因富集在MAPK和NF-κB信号通路。实验证实DJ-1缺失会导致Dusp1表达下降，同时激活P38MAPK通路。

Dusp1介导DJ-1对CVB3感染的抗凋亡作用

最终机制验证实验表明，在DJ-1缺陷背景下，Dusp1过表达能够减轻细胞凋亡，降低caspase-3活性，抑制P38MAPK通路激活，证明Dusp1是DJ-1发挥抗凋亡作用的关键下游介质。

这项发表在《Cell Death and Disease》的研究首次系统地阐明了DJ-1-Dusp1-P38MAPK轴在VMC发病过程中的重要作用。研究不仅证实了DJ-1的抗凋亡功能在心肌保护中的关键地位，还揭示了其通过调控Dusp1表达影响P38MAPK信号通路的具体分子机制。这一发现不仅深化了对VMC发病机制的理解，更重要的是为临床治疗提供了新的潜在靶点。虽然研究存在一定的局限性，如未评估DJ-1与其他心脏驻留细胞类型的相互作用，缺乏临床患者数据验证等，但无疑为开发针对VMC的新型治疗策略奠定了重要的理论基础。随着后续研究的深入，基于DJ-1的靶向治疗有望成为VMC患者的新希望。