PPA1通过AMPK/ULK1/FUNDC1介导的线粒体自噬在葡萄糖限制下促进结直肠癌氧化磷酸化及恶性进展

《Cell Death Discovery》：PPA1 promotes oxidative phosphorylation and malignant progression of colorectal cancer under glucose restriction via AMPK/ULK1/FUNDC1-mediated mitophagy

　　本研究聚焦结直肠癌(CRC)在葡萄糖限制微环境下的代谢适应难题，揭示了无机焦磷酸酶1(PPA1)的关键作用。研究人员发现PPA1通过激活AMPK/ULK1/FUNDC1信号轴，诱导线粒体自噬(mitophagy)，从而维持氧化磷酸化(OXPHOS)活性，为CRC细胞的增殖、迁移和侵袭提供能量支持。该研究阐明了PPA1驱动CRC恶性进展的新机制，为靶向肿瘤代谢提供了新的治疗策略。

　　

在全球范围内，结直肠癌(Colorectal Cancer, CRC)是第三大常见恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第二大原因，其晚期患者的五年生存率极低，III期和IV期分别仅为17%和14%。尽管治疗手段不断进步，但化疗耐药和早发性结直肠癌发病率上升等问题，使得开发新的治疗策略迫在眉睫。代谢重编程是癌症的一个标志性特征，长期以来，Warburg效应（即抑制氧化磷酸化并增强糖酵解）主导了人们对癌症代谢的理解。然而，越来越多的证据表明，线粒体呼吸在许多肿瘤中仍然保持功能，氧化磷酸化(Oxidative Phosphorylation, OXPHOS)在某些癌症中被上调以驱动增殖、转移和化疗耐药。在结直肠癌中，OXPHOS是ATP的主要来源，抑制OXPHOS可抑制肿瘤生长和转移。因此，深入理解结直肠癌在营养压力（如葡萄糖限制）下的代谢适应机制，对于发现新的治疗靶点至关重要。

在此背景下，研究人员在《Cell Death Discovery》上发表了他们的最新研究成果。为了阐明结直肠癌在葡萄糖限制下的生存机制，本研究综合运用了单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析、细胞功能实验（CCK-8、集落形成、Transwell、伤口愈合实验）、蛋白质印迹法(Western Blotting)、代谢组学分析、海马线粒体压力测试、免疫荧光染色、透射电子显微镜(TEM)观察以及裸鼠皮下异种移植瘤和肝转移模型等多种技术。临床样本包括从GEO数据库获取的GSE200997数据集（包含16个CRC组织和7个配对癌旁正常组织的scRNA-seq数据），以及从医院收集的48对CRC和癌旁正常组织。细胞实验主要使用了HCT8和HCT116等结直肠癌细胞系。

PPA1在CRC上皮细胞中过表达并与患者预后相关

为了探究CRC细胞与正常肠上皮细胞之间的肿瘤特异性转录变化，研究人员分析了GSE200997数据集。结果显示，与正常组织相比，CRC来源的上皮细胞中OXPHOS通路相关基因显著富集，且多数表达上调，这与经典的Warburg效应相反。其中，无机焦磷酸酶1(Inorganic Pyrophosphatase 1, PPA1)是上皮细胞中上调最显著的OXPHOS相关基因。对TCGA和GTEx数据库的批量RNA测序数据进行分析，也发现PPA1在CRC组织中表达显著高于正常结肠组织。研究人员进一步通过Western Blotting、qPCR和免疫组织化学染色在48对临床样本中验证了PPA1在CRC组织和上皮细胞中的高表达。利用组织微阵列(TMA)进行双免疫荧光共染色（以上皮细胞标志物EPCAM标记）证实，CRC上皮细胞中PPA1的平均荧光强度(MFI)显著高于癌旁正常组织。临床相关性分析表明，PPA1高表达与更高的T分期、淋巴结转移率、TNM分期以及更低的总生存率显著相关。这些发现表明PPA1影响CRC的恶性行为，可能是一个潜在的治疗靶点。

PPA1促进CRC细胞的增殖、迁移和侵袭

为了研究PPA1对CRC细胞生物学功能的影响，研究人员在HCT8和HCT116细胞中敲低或过表达了PPA1。功能实验表明，敲低PPA1显著抑制了CRC细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力，并逆转了上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)进程（E-钙黏蛋白表达上调，N-钙黏蛋白表达下调）。相反，过表达PPA1则促进了这些恶性行为。值得注意的是，在葡萄糖限制条件（0.25 mM葡萄糖）下，PPA1的敲低或过表达对细胞功能的抑制或促进作用更为显著，并且PPA1的表达本身在葡萄糖限制下也会上调。这强烈提示PPA1通过葡萄糖代谢相关通路调控CRC细胞的生物学行为。

PPA1促进CRC细胞的线粒体OXPHOS水平

鉴于PPA1的促癌效应在葡萄糖限制下更为显著，研究人员推测其可能通过代谢重编程发挥作用。代谢组学分析显示，敲低PPA1后，OXPHOS相关代谢物（如ADP、NAD⁺、琥珀酸）水平显著降低。对scRNA-seq数据的计算分析也表明，CRC上皮细胞的OXPHOS和糖酵解通路活性均高于正常上皮细胞。通过海马线粒体压力测试、细胞内ATP水平、NAD⁺/NADH比值、线粒体呼吸链复合体I活性等检测，证实敲低PPA1显著降低了CRC细胞的OXPHOS活性、ATP产生、NAD⁺/NADH比值和复合体I活性，并导致线粒体活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)水平升高和线粒体膜电位(ΔΨm)下降。而过表达PPA1则产生相反的效果。这些结果明确表明PPA1通过调控OXPHOS通路来调节CRC细胞的恶性行为。

PPA1通过AMPK/ULK1/FUNDC1轴介导的线粒体自噬维持OXPHOS

为了阐明PPA1调控OXPHOS的具体机制，研究人员对敲低PPA1的细胞进行了整合的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。磷酸化蛋白质组学结果显示，PPA1敲低导致ULK1（Unc-51-like autophagy-activating kinase 1）在Ser467、Ser556和Ser638位点的磷酸化水平降低，并伴随FUNDC1（FUN14 domain-containing 1）在Ser17位点的磷酸化水平降低。ULK1是自噬启动的关键激酶，可直接通过磷酸化级联反应协调线粒体自噬。FUNDC1是线粒体自噬的关键受体，ULK1介导的FUNDC1 Ser17位点磷酸化可启动线粒体自噬。后续实验验证，PPA1敲低并不改变ULK1和FUNDC1的总蛋白水平，但显著降低了ULK1（Ser467、Ser556、Ser638）和FUNDC1（Ser17）的磷酸化水平，以及自噬标志物LC3II/LC3I的比值。线粒体组分分析显示，PPA1敲低减少了LC3II在线粒体上的聚集。免疫荧光和透射电镜观察进一步证实PPA1敲低削弱了LC3与线粒体的共定位，减少了自噬溶酶体的数量，并导致线粒体肿胀和结构浓缩。这些结果表明PPA1敲低抑制了ULK1/FUNDC1介导的线粒体自噬，进而引发线粒体功能障碍和细胞凋亡增加。

ULK1 Ser467和Ser556位点的磷酸化促进FUNDC1 Ser17位点的磷酸化

通过构建ULK1的磷酸化位点突变体（S467A, S556A, S638A），研究人员发现，与野生型ULK1相比，S467A和S556A突变体显著降低了FUNDC1 Ser17位点的磷酸化水平、LC3II/LC3I比值以及LC3II在线粒体上的募集，并导致线粒体膜电位下降。而S638A突变体则无显著影响。这表明在葡萄糖限制下，ULK1在Ser467和Ser556位点的磷酸化特异性地诱导了FUNDC1 Ser17位点的磷酸化，从而促进CRC细胞的线粒体自噬。

ULK1激动剂LYN-1604促进FUNDC1介导的线粒体自噬和CRC细胞的恶性行为

使用ULK1的特异性激动剂LYN-1604处理PPA1敲低的细胞，可以挽救因PPA1敲低导致的ULK1（Ser467, Ser556）和FUNDC1（Ser17）磷酸化水平下降，恢复线粒体自噬水平、OXPHOS活性和ATP产量，并降低线粒体ROS水平。功能实验进一步证明，LYN-1604处理能显著增强PPA1敲低细胞的增殖、迁移和侵袭能力。这表明药理性激活ULK1可以逆转PPA1缺失带来的负面影响，维持CRC细胞的恶性表型。

PPA1通过AMPK促进ULK1的磷酸化

机制上游，研究人员发现PPA1敲低降低了AMPK（AMP-activated protein kinase）在Thr172位点的磷酸化水平，但不影响mTOR（mammalian target of rapamycin）的蛋白表达和磷酸化状态。使用AMPK激动剂GSK621处理PPA1敲低细胞，可以增强AMPK Thr172位点的磷酸化，并随之升高下游ULK1（Ser467, Ser555）和FUNDC1（Ser17）的磷酸化水平，恢复线粒体自噬，并促进CRC细胞的增殖、迁移和侵袭。这表明PPA1通过调节AMPK的磷酸化来调控ULK1依赖的线粒体自噬。

PPA1在体内促进CRC细胞的生长和肝转移

在裸鼠模型中，皮下注射PPA1敲低的HCT116细胞，其肿瘤生长速度和重量均显著低于对照组，且肿瘤组织中E-钙黏蛋白表达上调，N-钙黏蛋白表达下调。而过表达PPA1则促进肿瘤生长。通过脾脏注射建立肝转移模型，发现PPA1敲低组的肝脏转移灶数量和大小均显著少于对照组。这些体内实验进一步证实了PPA1在促进CRC生长和转移中的关键作用。

研究结论与意义

该研究最终得出结论：在葡萄糖限制的代谢压力下，PPA1通过促进AMPK在Thr172位点的磷酸化，进而激活ULK1（特别是Ser467和Ser556位点的磷酸化），并特异性诱导线粒体自噬受体FUNDC1在Ser17位点的磷酸化。这一磷酸化级联反应启动了保护性的线粒体自噬，清除了受损的线粒体，从而维持了健康的线粒体库功能和OXPHOS代谢活性，为结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭提供了能量支持，驱动了恶性进展。

这项研究的重要意义在于：首先，它揭示了PPA1在结直肠癌，特别是在营养匮乏的肿瘤微环境中一个新的、关键的促癌功能。其次，它详细阐明了PPA1通过AMPK/ULK1/FUNDC1信号轴调控线粒体自噬以维持OXPHOS的这一新颖分子机制，深化了对结直肠癌代谢适应性的理解。最后，该研究确定了PPA1是结直肠癌的一个有潜力的治疗靶点，尤其是在靶向肿瘤代谢和克服化疗耐药方面提供了新的思路。针对这一通路（如PPA1本身或其下游的AMPK/ULK1）的开发，可能为晚期结直肠癌患者带来新的治疗希望。