NuA3组蛋白乙酰转移酶复合物识别组蛋白并催化H3K14乙酰化的结构机制解析

《Nature Communications》：Mechanistic insights into histone recognition and H3K14 acetylation by the NuA3 histone acetyltransferase complex

　　本研究针对NuA3组蛋白乙酰转移酶复合物如何特异性识别组蛋白H3尾部并催化H3K14乙酰化的结构基础这一科学问题，通过冷冻电镜技术解析了NuA3复合物的apo状态、与乙酰辅酶A结合状态以及与组蛋白H3尾部及乙酰辅酶A三元复合物的高分辨率结构。研究发现由催化亚基Sas3和非催化亚基Nto1协同形成的疏水裂隙通过特异性识别H3尾部Gly13等关键残基实现底物特异性，揭示了MYST家族HAT复合物底物选择性的结构基础，为相关疾病治疗策略开发提供了新视角。

　　

在真核细胞中，遗传物质DNA通过与组蛋白组装形成染色质的高级结构，而染色质的动态变化直接影响基因的转录活性。组蛋白N端尾部可发生多种翻译后修饰，包括甲基化、乙酰化、磷酸化等，这些修饰构成复杂的"组蛋白密码"，精密调控基因表达模式。其中，组蛋白乙酰化能够中和组蛋白正电荷，降低染色质压缩程度，促进转录因子接近DNA，从而激活基因转录。这一过程由组蛋白乙酰转移酶（HAT）催化完成。

在酿酒酵母中，NuA3复合物作为MYST家族HAT复合物的代表，由Sas3、Nto1、Yng1、Eaf6、Taf14和Pdp3六个亚基组成，特异性催化组蛋白H3第14位赖氨酸（H3K14）的乙酰化。该修饰在转录激活、细胞周期进程和DNA损伤应答等生物学过程中发挥关键作用。值得注意的是，NuA3的染色质招募和催化活性受到组蛋白修饰状态的精密调控：Yng1亚基通过植物同源域（PHD）识别H3K4me3修饰，介导复合物靶向启动子区域；Pdp3亚基则通过PWWP结构域识别H3K36me3修饰，引导复合物至转录延伸区域；Taf14亚基的YEATS结构域可感知H3K9ac等修饰，协同促进复合物与染色质的结合。

尽管NuA3复合物的生物学功能已有较多研究，但其特异性识别组蛋白H3尾部并催化H3K14乙酰化的结构基础一直未被阐明。与其他可乙酰化多个位点的HAT复合物（如SAGA、NuA4）不同，NuA3表现出对H3K14的高度特异性，这种底物选择性的分子机制是领域内亟待解决的重要科学问题。理解NuA3复合物的结构与功能关系，不仅有助于揭示表观遗传调控的基本原理，也为开发针对HAT相关疾病的治疗策略提供理论依据。

为解决这一科学问题，上海科技大学免疫化学研究所张贺桥课题组与斯坦福大学Roger D. Kornberg教授合作，在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。研究人员通过冷冻电镜技术成功解析了NuA3复合物三种状态的高分辨率结构，系统揭示了该复合物识别组蛋白底物和催化乙酰化反应的分子机制。

研究采用的主要技术方法包括：利用昆虫细胞表达系统共表达酵母NuA3复合物六亚基并进行重组纯化；通过冷冻电镜单颗粒分析技术解析复合物三种状态（apo状态、与乙酰辅酶A结合状态、与组蛋白H3尾部和乙酰辅酶A三元复合物）的三维结构；利用体外组蛋白乙酰转移酶活性实验和质谱分析验证复合物功能；通过酵母遗传学实验在体内验证关键残基的功能重要性。

纯化、酶活性和NuA3复合物的整体结构

研究人员将NuA3复合物的六个亚基克隆至杆状病毒表达载体，在昆虫细胞中共表达并纯化得到完整的复合物。体外酶活实验证实，纯化的NuA3复合物在H3K4me3存在条件下，能够特异性乙酰化H3K14位点。通过优化样品制备条件（添加0.01% Tween-20），解决了冷冻电镜样品制备中的优势取向问题，获得了分辨率为3.7?的apo状态NuA3复合物结构。该结构清晰显示了Sas3、Nto1、Yng1、Eaf6和Taf14亚基的组装方式，而Pdp3亚基、Yng1的PHD结构域和Taf14的YEATS结构域由于柔性较高未能被解析。结构分析表明，Sas3催化亚基通过与Nto1亚基的相互作用形成复合物核心，而Yng1、Nto1的C端螺旋和Eaf6组装成螺旋束位于核心一侧，Taf14的ET结构域则与Sas3的N端结构域相互作用。

MYST家族成员共有的保守催化特征

Sas3的MYST结构域采用经典的组蛋白乙酰转移酶折叠模式，即中心β片层被α螺旋包围。与酵母Esa1以及人源HBO1、MOZ、MOF等MYST家族成员的结构比较显示，Sas3的催化残基Cys418和Glu452在序列和三维结构上均高度保守。点突变实验证实，这两个残基的突变会完全消除NuA3复合物的HAT活性，证明它们在催化过程中起关键作用。

亚基间的相互作用

Nto1亚基由N端EPL1-like结构域、中央PZP（PHD1-Zn-Kn-PHD2）结构域和C端螺旋结构域组成。结构分析显示，Nto1穿过由Sas3和Yng1形成的隧道，与多个亚基发生广泛相互作用。Nto1的PZP结构域包含两个PHD子结构域，通过锌指结构连接，形成五锌簇结构。C端螺旋结构域与Yng1的N端两个α螺旋、Eaf6以及Sas3的一个短螺旋（残基659-672）共同形成螺旋束。此外，Taf14的ET结构域与Sas3中特征性的ET结合基序（EBM）相互作用，这一发现支持了前人的研究结果。

NuA3复合物对组蛋白H3尾部的识别和乙酰化

为探究NuA3复合物如何顺序结合辅因子乙酰辅酶A和组蛋白底物，研究人员首先解析了Sas3-E452Q突变体与乙酰辅酶A结合的复合物结构（分辨率3.1?）。该结构显示，乙酰辅酶A与Sas3的C端结构域结合，通过Thr421、Arg427、Gly429、Gln432、Ser456、Thr462和Tyr561等残基形成极性相互作用。随后，研究人员解析了NuA3复合物与乙酰辅酶A及组蛋白H3尾部（携带H3K4me3和K14M突变）的三元复合物结构（分辨率3.2?）。与NuA4复合物相比，NuA3的组蛋白结合裂隙更深，由Sas3和Nto1共同形成。冷冻电镜密度图清晰显示了组蛋白尾部（残基9-18）和乙酰辅酶A的结合模式，两个催化残基Cys418和Glu452位于组蛋白第14位残基和乙酰辅酶A的乙酰基之间，表明结构捕获了反应前状态。

组蛋白尾部与结合裂隙的相互作用主要由疏水作用和氢键介导。由Sas3残基Leu369、Pro375、Phe376、Phe409、Phe580、Ile582、Met585以及Nto1残基Ile298、Phe299、Tyr357组成的疏水核心与组蛋白尾部N端残基（9-12）相互作用。Nto1的PHD2子结构域中的一个环（残基349-367，含FxN基序）与Sas3的C端结构域（特别是"CoA结合螺旋"和"组蛋白结合环"）共同稳定与乙酰辅酶A和组蛋白尾部的相互作用。具体而言，Nto1的Asn354与H3-Met14的骨架形成氢键，Sas3的Ser366与H3-Ala15的骨架形成两个氢键，组蛋白结合环中的Ser456骨架与组蛋白尾部的Arg17形成第四个氢键。点突变实验验证了这些相互作用的功能重要性：L369R突变完全消除HAT活性，而N354A突变导致活性部分降低。在酵母体内实验中，这些突变同样引起H3K14乙酰化水平下降，与体外实验结果一致。

乙酰辅酶A和组蛋白尾部结合诱导的NuA3复合物构象变化

三种状态（apo、与乙酰辅酶A结合、与组蛋白尾部和乙酰辅酶A结合）的结构比较揭示了复合物的构象变化。乙酰辅酶A结合后，组蛋白结合环向远离组蛋白结合裂隙的方向移动约2.5?，CoA结合螺旋发生构象重排。而组蛋白尾部结合后，这些元件的构象与乙酰辅酶A结合状态相比变化不大。这些构象变化可能扩大组蛋白结合裂隙，便于组蛋白尾部进入。鉴于组蛋白结合环靠近组蛋白尾部，且催化残基Glu452位于此环中，其构象变化可能重新定位催化残基以促进催化反应。

H3K14邻近残基对组蛋白尾部识别和乙酰化的影响

与NuA3不乙酰化的其他位点（如H3K9、H3K18、H3K27）前方为精氨酸不同，H3K14前方为甘氨酸（Gly13）。结构分析显示，G13R突变会与Sas3的Leu369和Nto1的Tyr357产生空间冲突。体外酶活实验证实，NuA3对H3G13R突变肽段的乙酰化活性显著降低。这表明Gly13在NuA3的底物特异性中起关键作用。此外，组蛋白H3尾部与结合裂隙的良好形状互补性提示，H3K9ac修饰、H3K4me与Yng1 PHD结构域的相互作用以及N端疏水接触和氢键网络可能共同参与NuA3对组蛋白底物的特异性识别。

该研究通过结构生物学、生物化学和遗传学方法，系统阐明了NuA3复合物特异性识别组蛋白H3尾部并催化H3K14乙酰化的分子机制。研究不仅揭示了由Sas3和Nto1协同形成的组蛋白结合裂隙的结构特征，还鉴定了介导底物特异性的关键残基，特别是Gly13的重要作用。此外，研究还发现NuA3与人类同源复合物BRPF1/2-HBO1在核心结构和底物识别机制上具有保守性，为理解MYST家族HAT复合物的进化与功能提供了新视角。

值得注意的是，由于技术限制，本研究未能解析Yng1 PHD结构域和Pdp3亚基的结构，也未能在核小体背景下研究H3K4me3或H3K36me3修饰对NuA3招募的影响。因此，NuA3a（通过Yng1识别H3K4me3）和NuA3b（通过Pdp3识别H3K36me3）两种功能形式的特异性结构差异仍有待进一步研究。

总之，这项研究填补了MYST家族HAT复合物结构生物学领域的重要空白，为理解表观遗传调控的分子机制提供了坚实基础，对开发针对HAT异常相关疾病（如癌症、神经退行性疾病）的治疗策略具有重要指导意义。