小胶质细胞病变：弗里德希共济失调模型中神经元死亡的主要介导因素

《Nature Communications》：Microgliopathy as a primary mediator of neuronal death in models of Friedreich’s Ataxia

　　本研究针对弗里德希共济失调(FRDA)中神经退行性变的细胞机制这一关键科学问题，通过利用患者来源的iPSC分化小胶质细胞(iMGs)和异种移植模型，首次证实了FXN基因缺陷导致的小胶质细胞功能紊乱（包括线粒体缺陷、铁超载和溶酶体异常）是驱动神经元死亡的独立致病因素。研究发现，CRISPR/Cas9介导的GAA重复序列校正可逆转小胶质细胞的病理表型并挽救神经元死亡，为FRDA的细胞靶向治疗提供了新策略。

　　

弗里德希共济失调（Friedreich's Ataxia, FRDA）是一种毁灭性的神经退行性疾病，患者常因进行性的运动协调能力丧失而深受其苦。这种疾病的根源在于FXN基因第一个内含子中出现了GAA三核苷酸重复扩增，导致细胞内至关重要的线粒体蛋白——弗拉塔辛（Frataxin, FXN）的表达严重不足。FXN在铁硫簇（Fe-S cluster）的生物合成和细胞能量生产中扮演着核心角色，它的缺失会引发一系列连锁反应，包括氧化磷酸化（OXPHOS）受损、活性氧（ROS）积累和铁代谢紊乱，最终对能量需求高的神经系统造成尤为严重的打击。尽管神经元死亡是FRDA明确的病理特征，但长久以来一个悬而未决的问题是：在患者大脑中观察到的免疫细胞——小胶质细胞的异常活化，究竟是神经元受损后引发的“旁观者”反应，还是主动参与甚至驱动神经元死亡的“罪魁祸首”？由于在动物模型中难以实现小胶质细胞特异性的FXN基因敲除，这个问题一直难以解答。

为了解开这个谜团，由Carla Pernaci和Nicole G. Coufal等领导的研究团队在《自然-通讯》（Nature Communications）上发表了一项突破性研究。他们巧妙地利用患者来源的诱导多能干细胞（iPSC）技术，成功在体外和活体内证明，FXN缺陷会直接导致小胶质细胞自身出现严重的功能失调（即“小胶质细胞病变”），而这种病变足以独立地引发健康神经元的死亡。更令人鼓舞的是，他们应用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功修复了患者iPSC中的GAA重复扩增，不仅逆转了小胶质细胞的病理表型，更有效地阻止了神经元死亡。这项研究首次确立了小胶质细胞作为FRDA疾病进展的关键独立驱动因素，为开发针对神经免疫系统的疗法提供了强有力的理论依据。

本研究的关键技术方法主要包括：利用FRDA患者、健康对照、家族携带者及经CRISPR/Cas9基因校正的等基因iPSC系进行小胶质细胞（iMG）分化；通过高内涵成像、 Seahorse线粒体压力测试、电子显微镜、流式细胞术等进行细胞表型分析；建立iMG与健康神经元的共培养体系；将人iPSC来源的造血祖细胞（iHPC）颅内移植到人源化且清除内源性小胶质细胞的免疫缺陷小鼠（Rag2^-/-Il2rg^-/-CSF1^h/h Csf1r^{△FIRE/AFIRE}）模型中，以研究人FRDA小胶质细胞（xMG）在活体内的作用。人死后小脑组织样本由美国国立卫生研究院神经生物库提供。

FRDA小胶质细胞在体外表现出激活的表型和形态

研究人员首先在FRDA患者的死后小脑组织中发现，小胶质细胞的分支复杂性降低，呈现出类似阿米巴状的激活形态。随后，他们建立了一个包含健康对照、FRDA患者、无症状家族携带者（杂合子）以及经CRISPR/Cas9基因编辑校正的iPSC系队列，并成功将其分化为小胶质细胞（iMG）。研究证实，FRDA iMG的FXN蛋白水平确实显著降低，而基因编辑有效恢复了其表达。这些FRDA iMG在形态上表现出分支长度和节点减少的激活特征，同时激活标志物CD68和Iba1的表达也显著升高，基因编辑则能有效缓解这种炎症状态。

FXN缺陷导致iMG线粒体功能障碍，基因编辑可予以纠正

FXN的缺失对细胞的“能量工厂”——线粒体造成了沉重打击。研究发现，FRDA iMG中线粒体特异性活性氧（MitoSox）大量积累，线粒体膜电位（MitoTracker DeepRed检测）显著降低。线粒体呼吸功能测定（Seahorse）显示，其基础呼吸和最大呼吸能力、以及ATP产量都严重受损。电子显微镜观察进一步揭示，FRDA iMG中的线粒体数量更多，且更多呈现球形，提示存在过度的线粒体分裂，其内部结构（嵴）也出现异常。所有这些线粒体缺陷都能通过基因编辑得到显著改善。

FRDA小胶质细胞吞噬功能亢进，伴有溶酶体功能受损

细胞器的正常运作对维持细胞健康至关重要。当研究人员用药物（CCCP）诱导线粒体应激后，发现FRDA iMG的线粒体自噬（mitophagy）能力下降，即清除受损线粒体的效率变低。与此同时，它们却表现出对酵母聚糖颗粒的“过度吞噬”（hyperphagocytic），其吞噬相关受体AXL的表达也升高。另一方面，负责降解任务的溶酶体也出现了问题：FRDA iMG的溶酶体数量更多、体积更大，但其内部的酸性环境（pH值）和酶活性却显著降低，表明溶酶体功能失调。基因编辑同样能够逆转这些功能异常。

细胞器稳态失衡导致FRDA小胶质细胞进入致病状态

线粒体和溶酶体的功能障碍引发了一系列恶性循环。FRDA iMG内出现了显著的铁超载（FerroOrange检测）、总体活性氧（CellROX检测）水平升高、中性脂质（BODIPY493/503检测）堆积以及脂质过氧化（BODIPY 581/591 C11检测）现象。这些氧化应激和损伤的最终后果是DNA损伤，表现为DNA双链断裂标志物γH2AX的焦点数量显著增加。而基因编辑再次发挥了保护作用，有效维持了细胞的稳态。

FRDA小胶质细胞诱导健康神经元发生退行性变

最关键的问题是，这些“病态”的小胶质细胞会对神经元产生什么影响？研究人员将FRDA iMG与健康的神经元共培养后，发现健康神经元内出现了铁积累、氧化DNA损伤标志物8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）增多、以及DNA双链断裂（γH2AX焦点）。更重要的是，与FRDA iMG共培养的健康神经元中，凋亡执行者——切割型胱天蛋白酶-3（cleaved caspase-3）的表达上调，神经元膜上也出现了典型的凋亡特征“泡”（blebs），表明神经元正在走向死亡。有趣的是，使用FRDA iMG的条件培养基并不能重现这一毒性效应，提示这种神经毒性作用更依赖于细胞间的直接接触，而非单纯通过释放可溶性因子介导。而将基因编辑后的iMG与健康神经元共培养，则能有效预防上述所有神经元损伤。

异种移植的人FRDA小胶质细胞在体内呈现高炎症状态

为了在更接近生理环境的活体中验证上述发现，研究团队将人iPSC来源的造血祖细胞（iHPC）移植到清除内源性小胶质细胞的人源化免疫缺陷小鼠脑中，这些祖细胞会定植并分化为功能成熟的人小胶质细胞（xMG）。八周后，在成年小鼠的小脑中，与健康对照和基因编辑组相比，FRDA来源的xMG更多地聚集在小脑浦肯野细胞层（PCL）和白质（WM）中。它们形态更接近阿米巴状，表达更高水平的吞噬标志物CD68，并表现出MHC II类分子（HLA-DR）上调而稳态标记P2RY12下调的激活表型，其自身的氧化DNA损伤（8-OHdG阳性）也更严重。移植基因校正的祖细胞则能阻止这种高炎症表型的出现。

人FRDA小胶质细胞破坏体内健康浦肯野细胞的存活

最有力的证据来自于对神经元存活的分析。在移植了FRDA xMG的成年小鼠小脑中，标志浦肯野细胞的钙结合蛋白（Calbindin）和1,4,5-三磷酸肌醇受体（IP3R）阳性神经元数量显著减少，而这些存活的浦肯野细胞胞体内积累了大量的8-OHdG，表明存在严重的氧化DNA损伤。值得注意的是，在发育早期（出生后21天），各组小鼠的浦肯野细胞数量没有差异，说明神经元丢失发生在成年期，是由FRDA小胶质细胞的长期病理作用导致的。此外，小脑颗粒细胞层（GCL）的神经元（NeuN阳性）密度也出现了下降，表明神经退行性变不仅限于浦肯野细胞。同样，移植校正后的xMG能有效防止小脑神经元的丢失。

综上所述，这项研究通过严谨的体外和体内实验，有力地证明了FXN缺陷直接导致人小胶质细胞发生细胞自主性的功能病变（微gliopathy），其特征为线粒体功能障碍、溶酶体异常、铁代谢紊乱和氧化应激，最终驱动了神经元的死亡。研究不仅将小胶质细胞提升为FRDA神经退行性变的一个独立致病介质，更重要的是，它验证了CRISPR/Cas9介导的基因编辑策略在逆转小胶质细胞病理表和神经保护方面的巨大治疗潜力。这些发现为正在探索中的、基于基因校正的造血干细胞和祖细胞（HSPC）移植疗法提供了坚实的临床前证据，表明通过替换中枢神经系统中的病态小胶质细胞，有望为FRDA患者带来新的希望。